11319 (Биотехнология глутамата натрия), страница 2

В результате одиннадцатой реакции пируват под влиянием пируваткарбоксилазы и при участии СО₂ и АТФ карбоксилируется с образованием оксалоацетата:

Двенадцатая реакция катализируется ферментом цитрат-синтетазой, при этом ацетильная группа ацетил-КоА конденсируется с оксалоацетатом, в результате чего образуется лимонная кислота:

Ацетил-КоА Оксалоацетат Цитрат

Тринадцатая реакция – дегидратация лимонной кислоты с образованием цис-аконитовой кислоты, которая, присоединяя молекулу воды, переходит в изолимонную кислоту. Катализирует эти обратимые реакции гидратации-дегидратации фермент аконитатгидратаза. В результате происходит взаимоперемещение Н и ОН в молекуле цитрата:

В результате четырнадцатой реакции происходит образование α-кетоглутарата. Изоцитрат дегидрируется в присутствии НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы. В ходе реакции изоцитрат одновременно декарбоксилируется. НАД-зависимый фермент является аллостерическим ферментом, которому в качестве специфического активатора необходим АДФ. Кроме того, фермент для проявления своей активности нуждается в ионах Mg²⁺ и Mn²⁺. Происходит выделение CO₂.

В ходе пятнадцатой реакции – ферментативного восстановительного аминирования α-кетоглутаровой кислоты НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназой – образуется глутаминовая кислота:

НООС – СН₂ – СН₂ – СО – СООН + НАД(Ф)Н₂ + NН₃ →

НООС – СН₂ – СН₂ – NН₂СН – СООН + НАД(Ф).

В ходе рассмотренных реакций видно, что для нормального протекания синтеза глутамата необходимо наличие в субстрате неорганического фосфорного питания, а также макро- и микроэлементов К, Mg, Mn, активирующих ферменты.

Сверхсинтез кислоты у дикого штамма возможен в специальных физиологических условиях при торможении скорости роста и увеличении проницаемости клеточной мембраны для глутаминовой кислоты. Такие условия обеспечивает определенная концентрация биотина в среде (1 – 5 мкг/л), а также присутствие некоторых антибиотиков. Внутриклеточная концентрация глутамата снижается в результате экскреции продукта в околоклеточную среду, поэтому регуляция синтеза конечным продуктом ослабевает.

Также для осуществления процесса биосинтеза глутаминовой кислоты с высоким выходом используют мутанты с нарушенной ферментативной системой превращения кетоглутаровой кислоты в янтарную (отсутствие или дефект кетоглутаратдегидрогеназы).

Рис. 3: Схема синтеза глутаминовой кислоты C. Glutamaticum.

Шестнадцатая реакция – образование глутамата натрия. Для этого раствор глутаминовой кислоты нейтрализуют 45-50% раствором едкого натра.

Условия биосинтеза

На биосинтез глутамата оказывают стимулирующее влияние биотин, тиамин и некоторые антибиотики (пенициллин, тетрациклин), спирты и ПАВ. Однако концентрацию биостимуляторов следует строго контролировать, так как при высокой концентрации, например, биотина, усиливается рост биомассы, но снижается выход глутаминовой кислоты (рис. 4). Также при избытке биотина и недостаточной аэрации образуются аланин и молочная кислота, что связано с потерями углеводов.

Процесс биосинтеза осуществляют в строго асептических усло-виях в ферментаторах объемом 50 м³ с коэффициентом заполнения аппарата 0,7 в течение 48-52ч интенсивной аэрации. Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной на уровне 28-30^оС. В течение всего процесса рН среды поддерживается на уровне 7,0-7,2.

Описание процесса биосинтеза

Синтез глутамата натрия осуществляется из глутаминовой кислоты, произведенной бактериями Coryn. Glutamicum.

Поскольку биосинтез глутаминовой кислоты предполагает высокую активность дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот, производственное культивирование должно проводится при интенсивной аэрации.

Воздух, подаваемый в ферментатор, выполняет несколько функций:

1. снабжает микроорганизмы кислородом

2. отводит газообразные продукты обмена

3. отводит теплоту, выделяемую микроорганизмами

4. создает однородность суспензии массы микроорганизмов

5. увеличивает скорость массопередачи и перемешивания жидкой среды.

На первом этапе происходит очистка атмосферного воздуха от пыли и его сжатие.

Атмосферный воздух поступает через фильтр предварительной очистки 1 в компрессор 2, где сжимается до необходимого давления (350-500кПа).

На втором этапе сжатый воздух необходимо поддерживать в оптимальном термодинамическом состоянии. При сжатии воздух нагревается до 100-200 градусов, поэтому его охлаждают в теплообменнике 3 до 25-30 градусов. При охлаждении сжатого воздуха конденсируется имеющаяся в атмосферном воздухе влага, которую отделяют во влагоотделителе 4. После отделения воды воздух нагревают до температуры культивирования микроорганизмов в теплообменнике-нагревателе 5. Далее воздух поступает в головной фильтр 6, где поддерживается его оптимальная температура и влажность. В этом фильтре происходит также и холодная стерилизация воздуха, так как вместе с частицами пыли отделяются и клетки микроорганизмов.

На третьем этапе осуществляется окончательная стерилизация воздуха в индивидуальном фильтре тонкой очистки.

Рис. 6: Технологическая схема приготовления посевного материала: 1-выращивания посевного материала в заводской лаборатории; 2-выращивание в инокуляторах объемом 2м³; 3- выращивание в инокуляторах объемом 5м³; 4- выращивание в биореакторах объемом 50м³.

Первая стадия (рис.6) выращивания посевного материала осуществляется в заводской лаборатории. Исходную культуру размножают на скошенной агаризованной среде в пробирке в стерильных условиях при оптимальных составе питательной среды и режиме выращивания (рН, температура, длительность).

Выращенную культуру стерильно смывают водой с поверхности агаризованной среды в колбы Эрленмейера вместимостью 750 мл, содержащие 50-100 мл жидкой питательной среды. Для промышленных штаммов С. glutamicum питательные среды содержат следующие компоненты (в %):

Меласса 8

Кукурузный экстракт 0,3

Хлорид аммония 0,5

Калия фосфат двухзамещенный 0,05

Сульфат магния 0,03

Вода остальное

рН среды 7,0-7,2

Колбы с культурой помещают на качалку, которая находится в термостатируемом помещении. Продолжительность выращивания культуры в колбах на качалке составляет 24 ч. Эта стадия выращивания контролируется по морфологическим показателям микроорганизма. Наилучшие показатели дает культура, которая находится в стадии физиологической зрелости в конце логарифмической фазы роста.

На второй стадии выращивания посевного материала (рис.6) готовую культуру из колб стерильно переносят в посевной аппарат (инокулятор) объемом 2м3. Происходит накопление биомассы до 6-8 г АСВ на 1 л среды в аэробных условиях. Состав питательной среды такой же как и при выращивании в колбах Эрленмейера, но с добавление 0,1% стерильного синтетического пеногасителя. Посевную культуру выращивают при температуре 28-32С в течение 18-24 ч и расходе воздуха 1 объем на 1 объем жидкости в 1 мин. В течение всего процесса рН среды поддерживается на уровне 7,0-7,2.

Третья стадия (рис.6) культивирования посевного материала повторяет вторую стадию, но процесс уже осуществляется в инокуляторах объемом 5м3. Для этого все содержимое малого инокулятора перекачивается в аппарат большего объема, в котором находится пострерилизованная питательная среда того же состава, что и использовалась на предыдущей стадии. Посевную культуру выращивают при температуре 28-32С в течение 18-24 ч и расходе воздуха 1 объем на 1 объем жидкости в 1 мин. В течение всего процесса рН среды поддерживается на уровне 7,0-7,2. По завершении процесса ферментации в посевных аппаратах культура не должна содержать фагов, посторонней микрофлоры и иметь титр около 109 клеток на 1 мл. Полученный посевной материал в количестве 5-6% (от объема среды производственных аппаратов) стерильно передают в основные ферментаторы.

Посевные аппараты на второй и третьей стадии оснащены мешалкой, аэрирующим устройством, а также контрольно-измерительной аппаратурой для регулирования температуры, рН, уровня пены и т.д. Количество посевного материала, передаваемое в инокуляты, может варьировать в широких пределах от 1 до 20% по объему. Коэффициент заполнения посевного аппарата в зависимости от конструкции его отдельных узлов составляет 0,5-0,7. Перемешивание среды достигается либо в результате барботажа стерильного воздуха либо турбинной мешалкой со скоростью вращения 300об/мин.

Четвертая стадия (рис.6) процесса осуществляется в основных биореакторах (рис.7) объемом 50м3 в течение 48-52 ч и интенсивной аэрации (80-85 мг О2/(л*мин)). Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной на уровне 28-30С. Такие аппараты должны обеспечить нормальный рост и развитие промышленного продуцента в асептических условиях; они снабжены необходимыми коммуникациями, теплообменниками, перемешивающими устройствами, штуцерами для подачи питательной среды и соответствующим оборудованием для ввода в нее стерильного воздуха, дополнительных питательных ингредиентов, растворов кислот и щелочей для поддержания рН среды на необходимом уровне, системами ввода стерильного пеногасителя и передачи культуральной жидкости на дальнейшую переработку. Перед началом культивирования ферментеры промывают и стерилизуют паром в течение 1 ч при 0,1 МПа.

Стерильная питательная среда (рис.8) в момент введения в биореактор имеет температуру, близкую к среде выращивания продуцента (28-30С), или около 80С. В последнем случае для достижения температуры проведения процесса культивирования жидкую фазу охлаждают подачей холодной воды в рубашку аппарата или в теплообменники, расположенные внутри самого ферментера.

Для промышленных штаммов С. glutamicum питательные среды на стадии биосинтеза содержат следующие компоненты (в %):

Меласса 20

Мочевина 2

Калия фосфат двухзамещенный 0,05

Сульфат магния 0,03

Вода остальное

рН 7,0-7,2

Дополнительно в питательную среду вводят мел до 1% и 0,1% синтетического пеногасителя. Мочевину вводят дробно, по мере потребления, чтобы содержание мочевины в среде не превышало 0,8%.

Посевной материал в количестве 5-10% от объема питательной среды поступает в ферментер. Коэффициент заполнения последнего составляет 0,7. Процесс ферментации продолжается при повышенном давлении 0,02-0,03 МПа, постоянной температуре 28-30С и контролируемом значении рН; периодически производится подача стерильного пеногасителя.

В первые сутки культивирования продуценты ассимилируют 25% углеводов и общего азота среды, в том числе почти все аминокислоты, в этот период образуется практически вся биомасса. Вторая стадия роста культуры сопровождается резким снижением скорости накопления биомассы и самыми высокими скоростями биосинтеза глутаминовой кислоты – 0,8-1,0 г/л*ч. Питательная среда сильно истощается, возможно значительное изменение рН раствора. На данном этапе осуществляют подтитровывание среды 25%-ным раствором аммиака. Последняя стадия культивирования может сопровождаться некоторой убылью биомассы за счет небольшого автолиза клеток и резким снижением скорости образования глутамата.

Контроль за ходом процесса биосинтеза осуществляют на разных этапах его проведения по оптической плотности раствора культуральной жидкости (по содержанию клеток продуцента), по содержанию субстрата в смеси или по сигналам датчиков рН и растворенного кислорода в ферментационной среде. К концу процесса биосинтеза готовая культуральная жидкость содержит до 50 г/л глутаминовой кислоты, концентрация оставшегося субстрата не более 0,5-1,0%. Выход глутаминовой кислоты по отношению к потребленным сахарам составляет 45-50%.

Количество накапливаемого глутамата удается повысить, если по мере исчерпания источников углерода и азота в среду по ходу процесса дополнительно вводить небольшие количества этих питательных веществ. Организация дробной «подпитки», общий объем которой не превышает 10% объема исходной жидкой фазы, приводит к активизации биосинтетической деятельности микроорганизмов. На мелассной среде осуществление дробной «подпитки» позволяет увеличить концентрацию образующегося в культуральной жидкости глутамата до 60/л.

Рис. 7: Схема ферментатора со вспомогательными устройствами: 1 – корпус ферментатора, 2 – вал смесителя с турбинами, 3 – электродвигатель с коробкой передач, 4 – сальник вала смесителя, 5 – спираль теплообменника, 6 – перфорированный барботер, 7 – устройство для определения расходов воздуха, 8 – фильтр для стерилизации воздуха, 9 – воздушный клапан с регулировочным вентилем, 10 – уловитель, наполненный фенолом, 11 и 12 – резервуары для стерилизации пеногасителя и дополнительной подачи питательной среды во время ферментации, 13 – трубопровод для питательной среды, 14 – выводной вентиль, 15 – вентиль для отбора проб.

Рис. 8: Схема непрерывного приготовления питательной среды: 1 и 2 – резервуары для растворения исходных веществ, 3 – резервуар для смешивания растворов, 4 – насос для передачи среды, 5 – колонна или инжектор для нагрева среды паром, 6 – закрытый сосуд для стерилизации, 7 – охладитель, 8 – резервуар для спуска нагретой воды, 9 – ферментатор

Пятая стадия включает в себя предварительную обработку культуральной жидкости. Осуществляется в результате добавление к ней определенного количества негашеной извести с последующим осаждением избытка ионов кальция фосфорной кислотой. Образующийся при этом осадок способствует лучшему отделению клеток продуцента и других балластных примесей.