11303 (Биосинтез мембранных белков и их встраивание в биомембрану), страница 2

Белки встраиваются в мембрану разными способами, но детали этого процесса во многих случаях еще не установлены. Для объяснения механизма встраивания предложены две модели: сигнальная гипотеза и мембранная триггерная гипотеза. В сигнальной гипотезе предполагается, что белок включается в мембрану параллельно его трансляции на мРНК в полирибосомах; это так называемое котрансляционное включение. Когда лидерная последовательность выходит из рибосомы, она выявляется некой сигнал-распознающей частицей (СРЧ), которая блокирует дальнейшую трансляцию на уровне примерно 70 аминокислот, 40 из которых остаются в большом рибосомном комплексе, а 30 экспонированы в среду. СРЧ содержит шесть белков, с ней ассоциирована 7S-РНК, близкородственная «Alu-семейству» последовательностей ДНК с большим числом повторов. Блокирование трансляции не снимается до тех пор, пока комплекс СРЧ-лидерная последовательность – рибосома не свяжется с так называемым «отстригающим» белком (рецептором для СРЧ) эндоплазматического ретикулума. В этот момент начинается котрансляционное встраивание в эндоплазматический ретикулум. В процессе элонгации оставшейся части белка он перемещается через липидный бислой, поскольку рибосома остается присоединенной к эндоплазматическому ретикулуму. Таким образом образуется шероховатый (усеянный рибосомами) эндоплазматический ретикулум. Рибосомы остаются прикрепленными к эндоплазматическому ретикулуму втечении всего времени синтеза мембранного белка и освобождаются и диссоциируют на соответствующие субъединицы только после его завершения. Когда ранее синтезированная часть белка выходит в просвет эндоплазматического ретикулума, отщепляется лидерная последовательность, и присоединяются углеводы.

Интегральные мембранные белки не пересекают мембрану целиком; по-видимому, этому препятствует гидрофильная якорная последовательность на С-конце. Секретируемые же белки проходят сквозь мембранный бислой полностью и высвобождаются в просвет эндоплазматического ретикулума. К моменту их поступления внутрь везикулы углеводные остатки уже оказываются связанными с ними. Впоследствии секретируемые белки обнаруживаются в просвете аппарата Гольджи, где происходит модификация их углеводных цепочек, а затем они перемещаются к специфическим внутриклеточным органеллам или клеточным мембранам либо секретируются. Некоторые белки пересекают одну мембрану, а затем заякориваются в другой, соседней мембране, например внутренней мембране митохондрий.

2.2 Мембранная триггерная гипотеза

В этой гипотезе особое значение придается роли лидерной последовательности в изменении третичной структуры самого белка. Согласно этой гипотезе, лидерная последовательность индуцирует такую упаковку обычно гидрофобного интегрального белка, что последний может оставаться солюбилизированным в водной среде цитоплазмы, где он синтезирован. Мембранный липидный бислой является как бы триггером по отношению к третичной структуре белка – последний переходит в такую конформацию, которая обеспечивает его предпочтительное включение в бислой. Таким образом, белок претерпевает некий переход и сам встраивается в мембрану таким способом, чтобы установить необходимую поперечную асимметрию. Сразу после встраивания белка или его интеграции лидерная последовательность отщепляется. Триггерная гипотеза не предполагает специфического взаимодействия между рибосомой и мембраной, но это еще не означает, что синтез белка не может происходить на мембранах. Возможно, в одной и той же клетке действуют оба механизма.

3. Полипептидные сигналы, отвечающие за сортировку белков и

встраивание их в мембраны

Об аппарате и механизме переноса почти ничего неизвестно, немного больше известно о сигнальных последовательностях, присутствующих в полипептидах и направляющих каждый белок в нужное место. Успехов в этой области удалось достичь благодаря использованию техники рекомбинантных ДНК. С ее помощью были сконструированы гибридные полипептиды, в которые была включена тестируемая аминокислотная последовательность, принадлежащая другому белку. Таким образом можно было изучать влияние предполагаемой сигнальной последовательности на локализацию «белка-пассажира». Преимущества такого подхода удается использовать только в том случае, если вся информация, определяющая локализацию конечного продукта, заключена в первичной последовательности сигнала и если «белок-пассажир» является нейтральным участником процесса и, что существенно, подчиняется сигналу. Это условие выполняется во многих случаях, но известны и такие примеры, когда эффективность переноса или даже конечная локализация зависят от «белка-пассажира». Если «белок-пассажир» находится в конформации, не способной к переносу, то может происходить блокирование переноса химерного белка. Кроме того, функция некоторых сигнальных последовательностей зависит от их локализации в полипептиде или от взаимодействия с другими участками полипептидной цепи.

3.1 Сигнальная последовательность, определяющая встраивание в

эндоплазматический ретикулум

У большинства белков, встроенных в мембрану эндоплазматического ретикулума или пересекающих ее, на N-конце имеется «короткоживущий» сигнальный пептид. Это сигнальная последовательность непосредственно взаимодействует по крайней мере с двумя рецепторами, один из которых растворим (сигнал-распознающая частица), а другой находится в мембране. Можно было бы ожидать, что аминокислотная последовательность этого сигнального пептида будет очень консервативной и примерно одинаковой у всех переносимых белков, но ожидания эти не оправдались. Эти сигнальные участки не отличаются постоянством ни в отношении длины, ни в отношении аминокислотной последовательности, а многочисленные опыты по мутагенезу показали, что они могут претерпевать значительные структурные изменения. Данные о том, что сигнальные пептиды содержат всю информацию, необходимую для транспорта белков через мембраны эндоплазматического ретикулума или внутрь их, были получены в опытах с химерными полипептидами. Присоединение N-концевой сигнальной последовательности к обычным цитоплазматическим белкам, например к глобину, приводило к тому, что они транспортировались в полость эндоплазматического ретикулума.

С точки зрения «сравнительной анатомии» N-концевых сигнальных последовательностей три разных в структурном отношении участка: 1) положительно заряженный N-концевой участок (n-участок); 2) центральное гидрофобное ядро из 7-15 остатков (h-участок); 3) С-концевой участок (с-участок), который является полярным и содержит сайт, узнаваемый сигнальной пептидазой, которая находится на стороне эндоплазматического рутикулума, обращенной в полость.

От небольших изменений в сигнальных последовательностях зависит, будет ли «белок-пассажир» секретироваться в полость эндоплазматического ретикулума или он останется прикрепленным к мембране, и какой будет ориентация N-конца мембранного белка.

3.2 Стоп-сигналы переноса

Для неотщепляемых сигнальных последовательностей, которые играют роль N-концевых якорей в образовавшемся мембранном белке, характерно наличие относительно длинных гидрофобных участков. Отсюда следует, что перенос может останавливаться просто при наличии протяженного гидрофобного участка, который способен образовать трансмембранную α-спираль. В пользу тассского предположения свидетельствуют некоторые экспериментальные данные. Например, с помощью рекомбинантной ДНК в среднюю часть белка Е.coli, в норме секретирующегося через плазматическую мембрану, встраивали гидрофобные сегменты. Если их длина была не менее 16 аминокислотных остатков, то транспорт белка блокировался, и он оставался присоединенным к плазматической мембране. Можно возразить, что в данном случае речь идет о бактериальной системе, но все-таки механизмы переноса в про- и эукариотических системах сходны. Далее были сконструированы варианты G-белка вируса везикулярного стоматита с измененными мембранными доменами. Длина гидрофобного сегмента могла составлять не 20, а 8 остатков, при этом полипептид оставался трансмембранным, хотя транспорт в плазматическую мембрану блокировался. Таким образом, природа стоп-сигнала переноса точно не известна. Необходимо выяснить два вопроса: 1) участвуют ли в остановке переноса специфические белки аппарата переноса; 2) определяется ли остановка переноса гидрофобностью стоп-сигнала или какими-то более тонкими факторами? Было показано, что участки стоп-сигнальной последовательности, ответственные за блокирование переноса через эндоплазматический ретикулум, могут никак не влиять на транспорт через мембрану хлоропласта. Это означает, что упомянутые два процесса могут существенно различаться.

Определение старт- и стоп-сигналов подразумевает линейную схему переноса, начинающегося с N-конца; об этом свидетельствует поведение простых систем. Однако оказалось, что последовательности, которые блокируют перенос в одном случае, могут инициировать его в другом. Следовательно, важна не только природа самих стоп- или старт-последовательностей, но и их окружение в полипептиде.

3.3 Использование синтетических сигнальных пептидов

Синтезированы пептиды, соответствующие сигнальной последовательности дикого типа, а также мутантные сигнальные пептиды белка LamB наружной мембраны и исследовано их взаимодействие с модельными фосфолипидными мембранами и везикулами Е.coli. Показано, что пептид, соответствующий сигнальной последовательности дикого типа, эффективно ингибирует in vitro перенос предшественников как периплазматичекого белка, так и белка наружной мембраны, а пептид, соответствующий мутантной сигнальной последовательности, дефектной по экспорту, не ингибирует перенос в бесклеточной системе. Это означает, что сигнальные пептиды узнают какой-то общий рецептор в цитозольной или мембранной фракции. Кроме того, эффективность связывания этих пептидов с модельными мембранами (монослоем и бислоем) коррелирует с их способностью служить сигналом переноса. Корреляция между гидрофобностью сигнальной последовательности и способностью инициировать транслокацию обнаруживается и при использовании предшественника мальтозосвязывающего белка.

Эти данные согласуются с моделью, согласно которой первичная сигнальная последовательность определяет локализацию полипептидного предшественника в мембране путем неспецифических взаимодействий с липидным бислоем, после чего осуществляется более специфическое связывание с белковым рецептором. Сходная модель была предложена для амфифильных пептидных гормонов. Но сигнальный пептид в животных клетках до его связывания с мембраной взаимодействует с каким-то растворимым рецептором. Какое значение для сигнального пептида имеет его способность связываться с липидами – остается неясным.

3.4 Сигнальные пептидазы

Для удаления временных N-концевых сигнальных пептидов необходимы специфические белки. Наиболее полно охарактеризованы сигнальные протеазы из Е.coli. Большинство экспортируемых белков Е.coli содержат сигнальный пептид, который отщепляется на периплазматической поверхности внутренней мембраны с помощью лидер-пептидазы; ее структура представлена на рис.2.

Рис.2. Предполагаемая топология лидер-пептидазы из Е.coli.

Аминокислотные остатки пронумерованы. Прямоугольниками обозначены гидрофобные сегменты. Первый гидрофобный участок не был обнаружен экспериментально, вывод о его существовании был сделан исходя из его гидрофобности. Наличие и ориентация второго гидрофобного участка установлены экспериментально и, по-видимому, он функционирует как внутренняя сигнальная последовательность. Третий гидрофобный сегмент имеет слабо выраженный гидрофобный характер и является частью периплазматического домена.

Для переноса белков через внутреннюю мембрану эта пептидаза не нужна, но она необходима для высвобождения экспортируемого белка из цитоплазматической мембраны. In vitro очищенный фермент мог функционировать, будучи включенным в липосомы. Специфичность расщепления весьма высока, но не определяется исключительно аминокислотной последовательностью вблизи сайта расщепления. Сигнальная пептидаза, функционирующая в эндоплазматическом ретикулуме, имеет ту же специфичность, что и соответствующий фермент Е.coli, что неудивительно, если учесть сходство сигнальных последовательностей. Была очищена сигнальная пептидаза из микросом эукариот. Показано, что она ассоциирована с другими полипептидами, возможно имеющими отношение к механизму переноса.

У Е.coli имеется вторая сигнальная пептидаза, участвующая в процессинге пролипопротеинов. Эти полипептидные компоненты оболочки Е.coli замечательны тем, что при созревании их N-конец модифицируется с помощью глицерида. Пролипопротеиновая сигнальная пептидаза также находится в цитоплазматической мембране. После отщепления сигнальный пептид остается в цитоплазматической мембране и разрушается с помощью мембраносвязанного фермента протеазы ΙV.

В митохондриях и хлоропластах должно присутствовать несколько сигнальных пептидаз, поскольку процессинг происходит более чем в одном компартменте. Растворимую пептидазу из митохондриального матрикса удалось частично очистить, но охарактеризована она не полностью.

4. Растворимые и мембраносвязанные белки, необходимые для

переноса

Идентифицировано несколько цитозольных и мембраносвязанных белковых компонентов, необходимых для переноса. Наиболее детально охарактеризованы белковые факторы, участвующие во встраивании белков в эндоплазматический ретикулум млекопитающих (рис.3).

1. Сигнал-распознающая частица (СРЧ). Это растворимый рибонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из шести разных белков и молекулы 7S-РНК. СРЧ необходима для инициации переноса. Она связывается с сигнальной последовательностью образующегося полипептида во время его синтеза на рибосоме. Для препролактина, например, константа диссоциации составляет 1нМ. С помощью метода фотохимического сшивания был идентифицирован один из полипептидов (54 кДа), непосредственно взаимодействующий с сигнальной последовательностью предшественника. По некоторым данным, полученным для бесклеточных систем, связывание СРЧ ингибирует трансляцию или вызывает ее задержку. Впрочем, не исключено, что этот феномен является артефактом; во всяком случае, как было показано на модельных опытах, его не обязательно привлекать для объяснения кинетики переноса белков in vivo. Одна из вероятных функции СРЧ состоит в предотвращении неправильного свертывания образующегося полипептида, которое может блокировать перенос (например, из-за экранирования сигнальных последовательностей). Задержка трансляции должна уменьшать вероятность такого ошибочного свертывания и, следовательно, увеличивать эффективность переноса белков.

Рис.3. Схематическое изображение ранних стадий котрансляционного переноса полипептида через эндоплазматический ретикулум млекопитающих.

Сигнал-распознающая частица и СРЧ-рецептор (стыковой белок) хорошо охарактеризованы. Мембраносвязывающий сигнальный рецептор изображен как компонент канала через мембрану, но существование таких каналов и роль сигнального рецептора не бесспорны. После образования комплекса между сигнальным пептидом и мембраносвязанным рецептором на стадии 3 СРЧ и стыковочный белок могут диссоциировать и принимать участие в новом цикле, оставляя мембраносвязанную рибосому и образовавшуюся цепь присоединенными к аппарату переноса.

Некоторые небольшие белки (<8,5 кДа) транспортируются в эндоплазматический ретикулум независимо от СРЧ. В их число входят препропептид GLa лягушки, препромеллитин (оба они являются предшественниками секретируемых белков) и пробелок оболочки фага М13. Во всех этих примерах конформация предшественника такова, что белки должны оставаться способными к переносу даже в отсутствии СРЧ и рибосом.