11303 (Биосинтез мембранных белков и их встраивание в биомембрану)

13

Пензенский Государственный Педагогический Университет

им. В.Г. Белинского

Курсовая работа на тему:

Биосинтез мембранных белков и их встраивание в биомембрану

Выполнила: студентка группы Бх-41

Данилова Елена

Проверил: к.б.н., \

Соловьев В.Б.

Пенза,2009

Содержание

Введение

1. Методы исследования переноса белков через мембраны

2. Встраивание белков в мембрану

2.1 Сигнальная гипотеза

2.2 Мембранная триггерная гипотеза

3. Полипептидные сигналы, отвечающие за сортировку белков и встраивание их в мембраны

3.1 Сигнальная последовательность, определяющая встраивание в эндоплазматический ретикулум

3.2 Стоп-сигналы переноса

3.3 Использование синтетических сигнальных пептидов

3.4 Сигнальные пептидазы

4. Растворимые и мембраносвязанные белки, необходимые для переноса

5. Сборка мультисубъединичных комплексов и обновление мембранных белков

Выводы

Литература

Введение

Процесс образования мембран начинается с синтеза белковых и липидных компонентов, которые затем должны быть доставлены к месту назначения. В состав мембран входят различные белки, для биосинтеза которых необходимы точные механизмы. В принципе имеются две главные проблемы, касающиеся сборки мембранных белков.

1. Все закодированные в ядре белки синтезируются общим пулом рибосом. В связи с этим возникает вопрос: как отдельные мембранные белки доставляются к месту назначения? Чем отличаются белки плазматической мембраны от белков внутренней митохондриальной мембраны или от белков мембран эндоплазматического ретикулума? Эту сложную проблему сортировки можно решить только при наличии определенных сигнальных последовательностей в каждом полипептиде, а также соответствующего аппарата узнавания.

2. Каков истинный механизм встраивания мембранных белков в мембрану и как при этом достигается правильная их ориентация относительно мембранного бислоя? Требуют ли механизмы встраивания и ориентации также наличия определенных сигнальных элементов и систем узнавания и если да, то каковы они? Какие свойства обеспечивают при встраивании мембранных белков формирование правильной третичной, а также четвертичной структуры в случае мультисубъединичных ансамблей?

За последние десятилетия в поиске ответов на эти вопросы достигнуты большие успехи, причем они становятся все более значительными. Это в большой мере обусловлено тем, что для выяснения роли специфических сигнальных полипептидных последовательностей в этих процессах стала использоваться рекомбинантная ДНК. Хотя не на все вопросы удалось найти ответы, полученные результаты все больше убеждают в том, что совершенно разные на первый взгляд системы в действительности обладают фундаментальным сходством. Например, не так давно было показано, что механизм секреции белков имеет много общего с механизмом синтеза белков плазматической мембраны. Совсем недавно достигнут большой прогресс в понимании общих принципов переноса белков через мембраны митохондрий, эндоплазматического ретикулума и грамотрицательных бактерий. Эти экспериментальные системы изучались наиболее интенсивно. И хотя между соответствующими процессами есть значительные различия, они имеют ряд общих особенностей.

1. Существует идентифицируемая часть полипептидной последовательности, которая служит участком узнавания, или «сигналом», направляющим отдельный полипептид к мембране, в которую он встраивается. Эти сигнальные участки часто расположены на N-конце новосинтезированного полипептида и отщепляются специфическими сигнальными пептидазами после встраивания его в нужную мембрану или переноса через нее. Для обозначения N-концевого сигнала различными авторами использовались следующие термины: сигнальный пептид, сигнальная последовательность, транзитный пептид, лидирующий пептид пре-последовательность.

2. Процессы трансляции и встраивания белков в мембрану можно разделить в эксперименте. Для сборки мембранных белков в большинстве случаев необходима энергия, отличающаяся по величине от той, которая требуется для их трансляции на рибосоме.

3. Связавшийся с мембраной-мишенью полипептид должен, кроме того, находиться в конформации, в которой может осуществляться его перенос через мембрану или встраивание в нее. Во многих случаях перенос белков через мембраны происходит от N-конца к С-концу, при этом необходимо, чтобы белок был, по крайней мере, частично развернут или слабо свернут. Полипептид может транслоцироваться в вытянутой форме в ходе энергозависимого процесса.

Особый интерес представляет процесс сборки мембранных белков. На рис.1 схематично показаны три общих механизма проникновения пептидного предшественника в мембрану. Механизмы А и Б являются вариантами схемы линейного вытеснения, согласно которой сигнальная последовательность направляет полипептид к переносящему устройству, которое включает в себя заполненный водой канал. Сигнальная последовательность может проходить прямо сквозь канал (механизм А) или оставаться связанной с мембраной, образуя, как показано на рис.1, петлю (механизм Б). В отсутствии какого-либо сигнала остановки процесса переноса полипептид будет транспортироваться через мембрану целиком. Однако если внутри полипептида имеется второй сигнальный пептид, называемый стоп-сигналом переноса, то процесс останавливается, и стоп-сигнал переноса становится трансмембранным сегментом зрелого мембранного белка. Фиксируя белок в мембране, стоп-сигнал переноса действует как сигнал сортировки.

Схема В на рис.1 иллюстрирует возможную роль самопроизвольного включения в мембрану гидрофобных элементов полипептидного предшественника. Этот механизм может реализовываться только тогда, когда включение в мембрану происходит после трансляции полипептида.

Рис.1. Три общие модели возможной сборки белков в мембране.

Две первые (А и Б) предполагают, что белок транспортируется в линейной форме через белковый канал. При наличии стоп-сигнала процесс останавливается, в противном случае через мембрану проходит весь белок. Модель В предполагает, что гидрофобные элементы полипептида самопроизвольно включаются в липидный бислой. Гидрофобный элемент может представлять собой одиночную спираль или более сложную структуру. Процесс может быть опосредован белками.

Проблема сборки белков очень важна. Этот процесс обычно не протекает самопроизвольно, лишь в результате взаимодействия между образующимися полипептидами и липидным бислоем. Напротив, он является энергозависимым и опосредуется белковыми структурами, которые пока не изучены в достаточной степени. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что перенос белков через мембрану (например, в полость эндоплазматического ретикулума) и сборка интегральных мембранных белков – это тесно связанные стороны одного и того же процесса. Логично ожидать, что проблемы транспортировки белков через мембраны и их укладки должны решаться одинаковым образом.

1. Методы исследования переноса белков через мембраны

Наиболее детально изучены бесклеточные системы, в которых гораздо легче количественно исследовать процессы переноса и протеолитического процессинга белков. Во всех этих системах используются мембранные везикулы или препараты органелл, у которых поверхность, обращенная в цитоплазму, «смотрит» наружу, поскольку перенос белков осуществляется из цитоплазмы. Этому условию удовлетворяют микросомы, полученные из эндоплазматического ретикулума секретирующих клеток, митохондрий и хлоропластов. Вывернутые везикулы можно получить из клеток Е. coli, они представляют собой удобный объект для изучения переноса белков в бесклеточной системе.

Полипептид-предшественник, находящийся во внешней среде, при соответствующих условиях будет переноситься внутрь пузырька или, по крайней мере, через мембрану пузырька или органеллы. За этим процессом обычно следят, добавляя протеазы во внешнюю среду. Степень защиты от протеолиза является мерой количества полипептида, транспортированного внутрь везикулы или органеллы. За ходом протеолитического процесса, осуществляемого сигнальной пептидазой, следят с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Белки, встроившиеся в мембрану, можно идентифицировать с помощью щелочной экстракции, при этом предполагается, что белки, которые связаны с поверхностью мембран, при такой обработке удаляются. Однако так бывает не всегда, поэтому результаты, полученные с помощью щелочной экстракции, необходимо интерпретировать с осторожностью.

В таких бесклеточных системах можно изучать биохимические условия переноса белков и идентифицировать необходимые растворимые компоненты. Кроме того, при этом можно варьировать природу переносимого полипептидного «субстрата».

При изучении бесклеточных систем были получены весьма важные данные об условиях, необходимых для переноса белков.

1. Посттрансляционный и котрансляционный перенос. Принято считать, что во всех исследованных системах перенос в мембраны или через мембраны может осуществляться независимо от трансляции. Убедительные данные на этот счет были получены для процесса переноса белков в хлоропластах и митохондриях, а также для переноса через бактериальную мембрану. Долгое время считалось, что перенос белков в эндоплазматический ретикулум или через мембраны эндоплазматического ретикулума всегда осуществляется параллельно трансляции, однако было четко показано, что такая параллельность не обязательна. Также важным считается то, что энергия, необходимая для переноса, не исходит от рибосомного биосинтетического аппарата.

2. Энергетические требования к переносу. Как правило, перенос белков в мембраны или через них энергозависим. Необходимым условием переноса как для прокариотических, так и для эукариотических систем является гидролиз АТР (или другого нуклеозидтрифосфата). Это было показано для следующих процессов: а) переноса белков в строму хлоропластов; б) транспорта белков в митохондриальный матрикс, внутреннюю и наружную мембраны; в) переноса белков через эндоплазматический ретикулум дрожжей и посттрансляционного встраивания мембранных белков в эндоплазматический ретикулум млекопитающих; г) переноса белков через цитоплазматическую мембрану Е.coli.

Еще одним независимым условием переноса белков в матрикс митохондрий и во внутреннюю мембрану митохондрий является наличие на последней трансмембранного потенциала. Этот потенциал, очевидно, необходим на ранней стадии процесса, при связывании белка с митохондрией.

3. Способность предшественника к переносу. Имеются веские доводы в пользу того, что ключевую роль в успешном переносе белка играет его четвертичная структура. Скорее всего это связано с тем, что сигнальная последовательность(ти), узнаваемая аппаратом переноса, должна быть доступна для него. Следовательно, для осуществления переноса белок должен быть неплотно свернут или частично развернут. Кроме того, если белки переносятся через мембрану в вытянутой конформации, то аппарат переноса должен быть способен к их развертыванию во время самого процесса переноса. Если бы белки- предшественники обладали стабильной четвертичной структурой, то они с трудом развертывались бы и, следовательно, не были бы способны к переносу.

Транспорт белков осуществляется в развернутом виде. АТР необходим для разворачивания полипептида. Разворачивание происходит до переноса или параллельно ему. На то, что именно АТР необходим для этого процесса, говорит тот факт, что транспорт укороченных предшественников в отличие от транспорта полноразмерного белка может осуществляться в отсутствии АТР. Впервые эти данные были сделаны на основе изучения митохондриальной мембраны. Для предотвращения свертывания предшественника в нативную конформацию необходим какой-либо растворимый белковый кофактор. Так, был выделен в водорастворимой форме, сходный порином митохондрий, предшественник белка наружной мембраны Е.coli OmpA, который был не способен к эффективному переносу через плазматическую мембрану, если в цитозоле отсутствовал белок, называемый «триггер-фактором». Известно также, что для переноса белков через мембраны эндоплазматического ретикулума млекопитающих или в эндоплазматичекий ретикулум необходим растворимый кофактор, а именно – сигнал-распознающая частица (СРЧ). Возможно, роль этого фактора состоит в предотвращении сворачивания предшественника полипептида.

2. Встраивание белков в мембрану

2.1 Сигнальная гипотеза