11298 (Биосенсоры: основы и приложения)

Министерство образования Российской Федерации

Пензенский Государственный Педагогический университет им.В.Г. Белинского

КУРСОВАЯ РАБОТА НА ТЕМУ

Биосенсоры: основы и приложения

Проверил

к. б. н. Соловьев В.Б.

Выполнила

Махнова Е.В.

Содержание

ВВЕДЕНИЕ 4

1. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 6

1.1 Сенсоры на основе микроорганизмов 6

1.2 Сенсор для определения усваиваемых сахаров 6

1.3 Глюкозный сенсор 7

1.4 Сенсор уксусной кислоты 9

1.5 Сенсор спиртов 10

1.6 Цефалоспориновый сенсор 11

1.7 Сенсор БПК 13

2. Основные биосенсоры на основе растительных и животных тканей 15

2.1 Биосенсор АМР 16

2.2 Биосенсор мочевины 18

2.3 Цистейповый биосенсор 19

2.4 Митохондриальные биосенсоры 20

2.5 Амперометрические биосенсоры 22

3. Возможное использование биосенсоров, применение биосенсоров в клинической медицине 25

3.1 Газы крови 26

3.2 Мониторинг калия 27

3.3 Глюкоза 29

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 34

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 35

ВВЕДЕНИЕ

Биосенсор - это устройство, включающее биологический чувствительный элемент, тесно связанный с преобразователем либо интегрированный с ним. Обычно биосенсор предназначен для формирования цифрового электрического сигнала, пропорционального концентрации определенного химического соединения или ряда соединений. Современная концепция биосенсора в значительной степени связана с идеями Лиланда Кларка-младшего и соавторов, развитыми в 1962г. Авторы предположили, что если бы ферменты можно было иммобилизовать на электрохимических датчиках, то такие "ферментные электроды" расширили бы диапазон аналитических возможностей базового датчика. Последовавшая затем грандиозная работа с бесконечными вариациями этой темы постепенно раздвинула горизонты этой области. Ее нынешнее состояние в какой-то степени характеризуют перечисленные ниже потенциальные чувствительные элементы и преобразователи, которые можно использовать при конструировании биосенсоров: биологические компоненты (целые организмы, ткани, клетки, органеллы, ферменты и тд), преобразователи (потенциометрические, амперометрические, кондуктометрические, оптические, калориметрические, механические, акустические, химические).

Развитие биосенсоров обусловлено усилием исследователей в нескольких направлений. Весьма перспективно е направление исследований - создание новых материалов для конструирования преобразователей или более эффективной связи между компонентами сенсора. Движущей силой в исследовании сенсоров было ярко выраженное инстинктивное понимание возможности их широких практических приложений. Эти исследования стимулировались прежде всего потребностями медицины. Возможность немедленного анализа клинических препаратов, очевидно, одинаково привлекает и врачей, и пациентов, хотя некоторые национальные службы здравоохранения испытывают трудности с внедрением этой философии. Более привлекательной является возможность непрерывного in vivo мониторинга метаболитов, лекарственных препаратов и белков с помощью миниатюрных и портативных систем. Отличным примером клинического приложения является сенсор глюкозы для больных диабетом, ставший классическим объектом исследований в области биосенсоров.

В последние годы возрастает интерес к другим возможным использованиям биосенсоров. Клинические исследования повернулись в сторону ветеринарии и животноводства. Все больше внимания придается качеству продуктов в пищевой промышленности. В этой области давно признано значение быстрых методов оценки сроков хранения, порчи и загрязнения продуктов. Развитие биотехнологии стимулирует разработку методов мониторинга процессов ферментации, что также расширяет возможности непрерывного контроля этих процессов. Проблемы охраны окружающей и промышленной среды стимулировали разработку сенсоров для определения таких вредных веществ, как оксид углерода и гербициды. В то же время интересы военных неизменно сосредоточены на специальных требованиях биологической и химической защиты.

1. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1.1 Сенсоры на основе микроорганизмов

В последние годы разработано множество биосенсоров для определения органических соединений. Многие ферментные сенсоры обладают высокой специфичностью по отношению к представляющим интерес субстратам, однако используемые в них ферменты дороги и неустойчивы. Микробные сенсоры состоят из иммобилизированных микроорганизмов и какого-либо электрохимического датчика и пригодны для непрерывного контроля биохимических процессов. Принцип работы микробных сенсоров - это ассимиляция органических соединений микроорганизмами, что регистрируется электрохимическими датчиками.

1.2 Сенсор для определения усваиваемых сахаров

При культивации микроорганизмов на патоке сахарного тростника, содержащей различные сахара, для контроля процесса брожения важно определение суммарного содержания усваиваемых Сахаров в среде. Так, при высокой концентрации сахара наблюдается подавление катаболизма, что приводит к подавлению роста клеток. Восстановленные сахара и сахарозу в культуральных средах можно определять феррицианидным методом. Этот метод, однако, не вполне надежен, поскольку неусваиваемые сахара могут мешать определению.

Усвоение органических соединений микроорганизмами можно оценивать по дыхательной активности последних, которую в свою очередь можно непосредственно измерить при помощи кислородного электрода.

Для непрерывного определения общего содержания усваиваемых Сахаров (глюкозы, фруктозы и сахарозы) в бродильной среде сконструирован микробный сенсор, состоящий из иммобилизованных живых клеток. Общее содержание усваиваемых Сахаров оценивали по потреблению кислорода иммобилизованными микроорганизмами. Добавление аликвотной части глюкозы приводило к увеличению поглощения кислорода в растворе. В результате электродный ток постепенно понижался, пока не достигал некоторого стационарного значения. Время отклика сенсора составляло 10 мин при измерении стационарного тока и 1 мин в импульсном режиме. Существует линейная зависимость между уменьшением тока и концентрацией глюкозы (до 1 мМ), фруктозы (до 1 мМ) и сахарозы (до 0,8 мМ) соответственно. Чувствительность микробного сенсора к этим сахарам оценивается соотношением 1,00: 0,80: 0,92. При использовании растворов, содержащих 0,8 мМ глюкозы, относительное стандартное отклонение для величины уменьшения тока составляло 2%. Общее содержание усваиваемых Сахаров рассчитывали, суммируя значения аналитических сигналов для откликов на глюкозу, фруктозу и сахарозу, при этом разность истинных и расчетных концентраций не превышала 8%. Микробный сенсор помещали в бродильную среду для получения глутаминовой кислоты, где он надежно работал более 10 дней и выдержал 960 измерений.

1.3 Глюкозный сенсор

Для определения глюкозы предложен микробный сенсор, состоящий из иммобилизованных целых клеток Pseudomonas fluorescens и кислородного электрода. Сенсор помещали в исследуемый раствор, который во время измерений насыщали кислородом и перемешивали магнитной мешалкой.

На рис.2.4 показана типичная зависимость сигнала сенсора от времени. При 30"С стационарный ток устанавливался в пределах 10 мин. Точное время отклика зависело от концентрации добавленной глюкозы. При удалении микробного сенсора из раствора и помещении в среду, не содержащую глюкозы, ток постепенно возрастал и возвращался к начальному уровню примерно за 15 мин при 30°С.

Сенсор проявляет слабую чувствительность к фруктозе, галактозе, манозе, сахарозе и не чувствителен к аминокислотам. Поэтому избирательность определения глюкозы при помощи этого микробного сенсора можно считать вполне удовлетворительной. При измерениях стационарного тока зависимость между током и концентрацией глюкозы линейна до концентрации 20 мг/л, причем нижняя граница определяемых концентраций глюкозы составляла 2 мг/л. При содержании глюкозы 10 мг/л значение тока воспроизводилось с точностью +6%. Стандартное отклонение составило 6,5 мг/л при числе опытов более 20.

Микробный глюкозный сенсор позволяет определять концентрацию глюкозы в патоке со средней относительной погрешностью ±10%. Для сравнения глюкозу определяли также ферментным методом; результаты коррелируют с полученными электрохимическим методом.

1.4 Сенсор уксусной кислоты

При выращивании микроорганизмов на уксусной кислоте как источнике углерода избыток кислоты подавляет их рост и, следовательно, ее оптимальную концентрацию следует поддерживать с помощью непрерывного контроля в режиме "на линии".

Пористую мембрану с иммобилизованными дрожжами закрепляли на поверхности тефлоновой мембраны кислородного электрода и покрывали другой газопроницаемой тефлоновой мембраной. Таким образом, микроорганизмы помещались между двумя пористыми мембранами. Микробная сенсорная система состояла из проточной ячейки с водяной рубашкой, магнитной мешалки, перистальтического насоса, автоматического дозатора и самописца, регистрирующего ток.

Принцип работы этого сенсора аналогичен описанному выше. Поскольку ацетат-ионы не могут проходить через мембрану, рН пробы поддерживали существенно ниже рК уксусной кислоты (4,75 при 30°С). Что касается избирательности микробного сенсора по отношению к уксусной кислоте, то следует отметить, что он не чувствителен к таким летучим соединениям, как муравьиная кислота и метанол, или нелетучим компонентам питательной среды, таким, как глюкоза или фосфат-ионы. Tiichosporon brassicae могут потреблять пропионовую, н-бутановую кислоты и этанол, однако при ферментации эти вещества обычно отсутствуют либо их концентрация слишком мала, чтобы мешать определению уксусной кислоты.

Для сравнения концентрацию уксусной кислоты в бродильной среде для производства глутаминовой кислоты определяли описанным микробным сенсором и методом газовой хроматографии. Наблюдается хорошее согласие результатов, полученных двумя методами: коэффициент корреляции равен 1,04 для 26 опытов. Выходной сигнал сенсора (0,29-0,25 мкА) был постоянен (с точностью до +10% от исходного значения) более трех недель, при этом было выполнено 1500 измерений. Теперь этот микробный сенсор выпускается в Японии серийно.

1.5 Сенсор спиртов

В бродильных производствах необходимо непрерывно определять концентрации метанола и этанола в культуральных средах. При использовании спиртов в качестве источника углерода для культивируемых микроорганизмов концентрация спиртов должна поддерживаться на оптимальном уровне, чтобы избежать ингибирования субстратом. Как известно, спирты утилизируются многими микроорганизмами, следовательно, такие микроорганизмы можно использовать для конструирования спиртового сенсора [5].

Этанольный сенсор включает иммобилизованные Trichosporon brassicae и кислородный электрод. Способ иммобилизации клеток и конструкция электрода такие же, как в глюкозном сенсоре.

Для измерений этим сенсором в стационарных условиях требуется много времени, поэтому был использован импульсный метод, обеспечивающий отклик в течение всего 6 мин. Линейная зависимость между уменьшением тока и концентрацией этанола наблюдается в диапазоне концентраций от 2 до 22,5 мг/л. Для пробы с концентрацией этанола 16,5 мг/л разностный токовый сигнал воспроизводим с относительной погрешностью 6%. Стандартное отклонение составило 0,5 мг/л при числе опытов, равном 40.

Сенсор не проявляет чувствительности ни к летучим соединениям, таким, как метанол, муравьиная, уксусная и пропионовая кислоты, ни к нелетучим веществам.

Микробный этанольный сенсор использовали в дрожжевых бродильных средах. Определение концентрации этанола в тех же пробах методом газовой хроматографии дало результаты, сравнимые с полученными при помощи микробного сенсора: коэффициент корреляции составил 0,98 при числе опытов более 20. В диапазоне концентраций этанола 5,5-22,3 мг/л выходной ток сенсора оставался постоянным более трех недель, в течение которых было проведено 2100 анализов. Сейчас этот сенсор выпускается в Японии серийно.

1.6 Цефалоспориновый сенсор

Антибиотики обычно определяют с помощью турбидиметрического или титриметрического микробиологического анализа, однако методики такого определения довольно сложны и непригодны для экспрессных анализов.

Известно, что Citrobac'ter freundii вырабатывает фермент цефалоспориназу, который катализирует реакцию цефалоспорина с выделением протона:

Цефалоспориназа, однако, очень неустойчива и не подходит для изготовления ферментного сенсора. В сенсоре, чувствительном к цефалоспорину, можно использовать целые клетки Citrobacter freundii, которые иммобилизуют в коллагеновой мембране, помещаемой затем в мембранный реактор.

На рис.2.8 показана система для непрерывного определения цефалоспоринов. Она включает реактор мембранного типа с прокладкой в середине. Измерения рН, обусловливаемые ферментативной реакцией, измеряли комбинированным стеклянным электродом и регистрировали с помощью самописца.

При введении в реактор растворов, содержащих различные количества цефалоспоринов, разность потенциалов на электродах постепенно увеличивалась, пока не достигала некоторого максимума. Минимальное время отклика системы зависело от скорости потока и активности иммобилизованных бактерий в коллагеновой мембране.

При скорости потока 2 мл/мин максимальная разность потенциалов достигалась через 10 мин.