10505 (Репликация, сохранение и модификация генома), страница 2

Наиболее полно изучена ДНК-полимераза I E. coli. Она представляет собой одиночный полипсптид с мультифункциональными активностями. В качестве ДНК-полимеразы Pol I катализирует перенос 5'-дезоксинуклеотидильных единиц дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов к 3'-ОН-группе в цепи ДНК или РНК, после чего происходит спаривание перенесенного основания с соответствующим основанием комплементарной цепи ДНК. Таким образом, для полимеризации ферменту необходимы праймер в качестве дезоксинуклеотидного акцептора и матрица, детерминирующая присоединение нужного нук-леотида. Помимо полимеризации нуклеотидов, Pol I катализирует две другие реакции, биологическая роль которых очень важна. В одной из них происходит гидролиз фосфодиэфирных связей в одной цепи ДНК или на неспаренном конце дуплексной ДНК, причем за один акт удаляется один нуклеотид, начиная с З'-конца цепи. Вторая реакция также состоит в отщеплении нуклеотидов, но гидролиз начинается с 5'-конца дуплексной ДНК в направлении к 3'-концу. Эти различные активности присущи разным сайтам полипептидной цепи Pol I. Если in vitro обработать Pol I трипсином, то полипептидная цепь расщепится на большой и малый фрагменты. Большой, С-концевой фрагмент сохраняет ДНК-полимеразную и 3'-5'-экзонуклеазную активности; малый, N-концевой фрагмент обладает только 5'-3'-экзонуклеазной активностью.

Pol I и присущие ей экзонуклеазные активности играют очень большую роль в репликации и репарации хромосомной ДНК E. coli.3'-5'-экзонуклеаз-ная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов с растущего конца цепи. Если эта активность подавлена в результате каких-то мутаций в гене, кодирующем Pol I, то при репликации генома часто происходят мутации - замены оснований.

Способность ДНК-полимеразы удлинять 3'-ко-нец цепи, спаренной с матричной цепью, позволяет ей заполнять пробелы между сегментами отстающей цепи. Pol I удлиняет фрагменты Оказаки с 3'-концов и удаляет рибонуклеотиды, с которых начинаются 5'-концы соседних фрагментов, что является необходимой предпосылкой для формирования непрерывной отстающей цепи. Поскольку Pol I способна удлинять 3'-конец одной из цепей в месте разрыва в двухцепочечной ДНК и удалять нуклеотиды с 5'-конца того же разрыва. этот фермент играет ключевую роль в репарации поврежденной ДНК. Ник-трансляция широко используется in vitro для синтеза радиоактивно меченной ДНК.

У Е. coli имеются и две другие ДНК-полимеразы, но они присутствуют в клетке в меньших количествах. Pol II присоединяет нуклеотиды значительно менее эффективно, чем Pol I, и не обладает 5'-3'-эк-зонуклеазной активностью. Следовательно, Pol II может заполнять пробелы между фрагментами ДНК, спаренными с матричной цепью, но не способна отщеплять РНК-нуклеотиды от фрагментов Оказаки или осуществлять ник-трансляцию. Роль Pol II в репликации и сохранении хромосомной ДНК E. coli до настоящего момента неясна.

Pol III-холофермент - это ключевой фермент, ответственный за репликацию хромосомной ДНК E. coli. В каждой клетке содержится только 10-20 копий Pol III-холофермента, и тем не менее он является основным компонентом мультиферментного комплекса, инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, участвующего в элонгации лидирующей цепи в вилке и удлиняющего РНК-праймеры с образованием фрагментов Оказаки. Но поскольку Pol III-xo-лофермент не обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью, для репликации отстающей цепи необходимо участие Pol I, чтобы произошло удлинение продукта, образовавшегося при участии Pol III, и удаление РНК-праймеров на 5'-конце фрагментов Оказаки.

Обнаружены изменения в полипептидной цепи основного фермента Pol III, известны аминокислотные замены, которые позволяют приписать определенные виды ферментативной активности конкретным субъединицам ферментного комплекса. Так, а-субъединица обладает полимеразной активностью, а £-субъединица - 3'-5'-экзонуклеазной. Однако комплекс а - и £-субъединиц обладает значительно более высокой полимеразной и экзонуклеазной активностями, чем каждая из соответствующих субъединиц в отдельности. Функция третьей, 9-субъединицы пока неясна.

Помимо субъединиц, составляющих Pol III-кор, Pol III-холофермент содержит еще семь субъединиц: т, у, в, б, б', х и г|). Перечисленные полипептиды также существуют во множестве копий, так что в результате мол. масса комплекса составляет примерно 10³ кДа. Роль в-субъединицы заключается в том, чтобы свести к минимуму вероятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования; точная же функция других субъединиц неизвестна. Вполне возможно, что

Pol III-холофермент существует в двух формах, каждая из которых содержит определенный набор вспомогательных субъединиц, придающих ферменту определенные свойства. В одной форме фермент катализирует синтез непрерывной ведущей цепи, а в другой - прерывистой отстающей.

Pol III-холофермент катализирует те же реакции синтеза, что и Pol I, но работает примерно в 60 раз быстрее. Более того, Pol III-холофермент обладает повышенным сродством к матрице и обеспечивает более высокую эффективность копирования. Pol III-холофермент может связываться и с другими белками, увеличивая эффективность процесса копирования благодаря координации некоторых важных ферментативных этапов репликации. На этом более высоком уровне организации в комплексы могут включаться белки, расплетающие спираль ДНК в точках начала репликации и в репликативных вилках, инициирующие образование праймерных РНК, обеспечивающие последовательное наращивание цепей ДНК, терминирующие процесс репликации и разделяющие дочерние спирали ДНК.

ДНК-полимеразы, синтезируемые другими бактериями и многими бактериофагами, различаются по своим физической структуре и свойствам. Тем не менее катализируемые ими реакции практически идентичны реакциям, изученным у Е. coli. У всех ДНК-полимераз есть корректирующая 3'-5'-экзо-нуклеаза, однако 5'-3'-экзонуклеаза у некоторых ферментов отсутствует. Например, ДНК-полимераза фага Т4 может осуществлять 3'-5'-экзонук-леазную реакцию коррекции ошибок, но не способна катализировать 5'-3'-экзонуклеазную реакцию и поэтому не может обеспечить ник-трансляцию. При репликации ДНК фага Т4 5'-3'-экзонуклеазную реакцию удаления РНК-праймеров перед объединением фрагментов Оказаки катализирует другой кодируемый фагом белок. В процессе прерывистого синтеза отстающих цепей и репарации повреждений ДНК фага Т4 этот фермент работает согласованно с фаговой ДНК-полимеразой.

В эукариотических клетках идентифицировано множество ДНК-полимераз, но их физические и функциональные свойства изучены менее детально, чем у соответствующих ферментов прокариот. Из клеток млекопитающих выделены четыре ДНК-полимеразы: а, в и б содержатся в ядрах, а у - в митохондриях. ДНК-полимераза а участвует в репликации хромосомной ДНК. Ее полимеразная активность связана с большим полипептидом, но она существует и, возможно, функционирует как муль-тисубъединичный белок, аналогично Pol III-холоферменту E. coli. в-Полимераза - это одиночный полипептид, функцией которого является заполнение пробелов при репарации повреждений ДНК. Митохондриальная полимераза у, состоящая из четырех идентичных полипептидов, ответственна за репликацию митохондриального генома. б-Полимераза похожа на полимеразу а по своим молекулярным и синтетическим свойствам и также участвует в репликации хромосомной ДНК. Поскольку а-, в - и у-ДНК-полимеразы млекопитающих лишены 3'-5' - и 5'-3'-экзонуклеазных активностей, присущих ферментам Е. coli, остается неясно, как в процессе репликации ДНК у этих организмов удаляются случайно включенные ошибочные нуклеотиды и РНК-затравки на концах фрагментов Оказаки.

Некоторые вирусы животных индуцируют синтез особых полимераз для репликации своих геномов. Другие вирусы образуют белки, которые стимулируют системы репликации клеточной ДНК или участвуют в репликации вирусной ДНК. Например, паповавирусы синтезируют белки, необходимые для инициации репликации. Аденовирусы человека кодируют белки, "запускающие" инициацию синтеза обеих цепей линейной вирусной ДНК. Они продуцируют также особые ДНК-связывающие белки, облегчающие репликацию.

ДНК-лигазы. ДНК-лигазы необходимы для соединения цепей ДНК при репликации, репарации и рекомбинации. Все известные лигазы способны образовывать фосфодиэфрные мостики между 5'-фосфорильной и 3'-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрывов ДНК. ДНК-лигаза, индуцируемая в E. coli после заражения клетки фагом Т4, уникальна по своей способности соединять двухцепочечные фрагменты ДНК по концам разрыва. Физиологическая роль этой реакции неизвестна, но практическое ее значение в манипуляциях с рекомбинантной ДНК неоценимо.

ДНК-лигазы некоторых бактерий, бактериофагов и млекопитающих выделены и их структура и механизм каталитической активности установлены. ДНК-лигазы Е. coli, T4 и Т7-это одиночные полипептидные цепи, либо АТР, либо его производного - никотинамид-адениндинуклеотида. Реакция протекает в несколько этапов:

1) аденилильная единица NAD или АТР переносится на £-аминогруппу лизинового остатка лигазы с одновременным высвобождением никотинамидмононуклеотида или неорганического фосфата соответственно;

2) аденилильная группа переносится от белка на 5'-фосфорильную группу концевого остатка цепи ДНК с образованием пирофосфорильного производного, аденилил-ДНК;

3) аденилильная группа, связанная с 5'-фосфорильной группой, замещается 3'-гидроксильной группой прилегающего конца ДНК. В результате этих реакций происходит образование фосфодиэфирных связей в цепи ДНК за счет энергии гидролиза пирофосфорильной связи NAD или АТР. Для образования фосфодиэфирной связи во всех случаях, кроме лигазы фага Т4, должно произойти соединение нуклеотида, содержащего акцепторную 3'-гид-роксильную группу, с соседним нуклеотидом, несущим активированную 5'-фосфорильную группу. ДНК-лигазы Е. coli и фага Т4 могут соединять концы двух разных дуплексных фрагментов или разорванные концы цепей линейной или кольцевой ДНК. Таким образом, с помощью ДНК-лигаз могут образовываться и линейные, и кольцевые дуплексные молекулы ДНК.

е. Для репликации необходимо раскручивание спирали

Для осуществления комплементарного копирования цепей двухцепочечная ДНК должна постепенно раскручиваться. Раскручивание, или расплетание, спирали происходит только в локальном участке репликативной вилки. Расплетание - это не спонтанный процесс, в нем участвуют белки двух типов. Одни из них, называемые ДНК-гелика-зами, используют для разделения цепей энергию, высвобождающуюся при гидролизе АТР до ADP. Геликазы часто функционируют в составе комплекса, осуществляющего перемещение репликативной вилки и репликацию расплетенных цепей. Вообще говоря, для расплетания достаточно одного геликазного белка, но для того, чтобы максимизировать скорость раскручивания, несколько геликаз могут действовать совместно. Белки второго типа, дестабилизирующие спираль, - это белки, связывающиеся с одноцепочечными участками и тем самым стабилизирующие расплетенный дуплекс. Итак, геликазы вызывают локальное раскручивание двойной спирали, а другие специфические белки тотчас связываются с образовавшимися одноцепочечными участками, обеспечивая условия для комплементарного спаривания.

При репликации хроматиновой ДНК эукариотических организмов возникают дополнительные сложности. Чтобы расплести ДНК в составе хроматина, необходимо разрушить сильно конденсированный комплекс гистонов и ДНК, а по завершении репликации вновь упаковать две дочерние спирали в сложные хроматиновые структуры. Каким образом раскручиваются эукариотические хромосомы при подготовке к репликации? Об этом известно очень мало. Развернутые, предсуществующие и новые нуклеосомы должны ассоциировать с синтезированной дуплексной ДНК. Чтобы предотвратить образование слишком протяженных участков несвязанной ДНК в период репликации, сборка хроматина должна происходить параллельно образованию дуплексной ДНК. Связываются ли родительские гистоновые октамеры с одной или обеими дочерними спиралями - пока неизвестно.

Топологические проблемы раскручивания и репликации ДНК. Процесс раскручивания двойной спирали в репликативной вилке порождает механические и топологические проблемы. В принципе расплетание линейной дуплексной ДНК может происходить благодаря вращению родительской спирали вокруг собственной оси. Однако вращение очень длинных цепей ДНК вокруг длинных же осей во внутриклеточном пространстве механически затруднено. При репликации замкнутых кольцевых ДНК расплетание цепей в вилке создает дополнительные проблемы. По мере раскручивания цепей степень отрицательной сверхспиральности сегментов, находящихся перед вилкой репликации, постепенно уменьшается и в них возникает положительная сверхспирализация. Дальнейшее перемещение вилки вдоль кольца затрудняется и в конце концов блокируется. Это блокирование снимается путем внесения одноцепочечного разрыва. Тем самым образуется "шарнир", который дает возможность нереплицированному дуплексу, находящемуся перед вилкой, вращаться вместе с ней. Такие разрывы вносятся в ДНК с помощью ферментов, имеющих общее название ДНК-топоизомеразы.