166662 (Белки и нуклеиновые кислоты), страница 6

Применение в определенной последовательности выше перечисленных методов позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный, однако, некоторых примесей солей. Для полного очищения белков от низкомолекулярных примесей используются методы диализа, кристаллизации, гельхроматографии и ультрафильтрации.

Является ли полученный белковый препарат индивидуальным белком или смесью имеет важное значение. Всегда можно ожидать, что в составе изолированного белка есть примесь других белков; это может привести к неправильным выводам о свойствах исследуемого белка. Поэтому большое внимание уделяется оценке гомогенности – однородности белков. Критерием чистоты белков служат следующие показатели: получение белка в кристаллическом состоянии; дальнейшая неразделяемость при электрофорезе и ультрацентрифугировании; независимость растворимости от количества твердой фазы; постоянство аминокислотного состава; определенный молекулярный вес; для многих белков – постоянство специфических биологических свойств (ферментативная активность, гормональная активность и т.д.)

1. Классификация белков

Белки в зависимости от химического строения делят на простые и сложные. Простые белки при гидролизе распадаются только на аминокислоты. При гидролизе сложных белков наряду с аминокислотами образуется вещество небелковой природы – простетическая группа. Классификация простых белков основана на их растворимости.

Альбумины – водорастворимые белки с высокой гидрофильностью, выпадают в осадок при 100%-ом насыщении сульфатом аммония. К этим белкам относятся белок куриного яйца, белки зародыша семян злаковых и бобовых культур. Альбумин пшеницы называют лейкозин, гороха – легумелин. Альбумины содержат все незаменимые аминокислоты.

Глобулины – растворяются в солевых растворах, чаще всего для извлечения глобулинов используют 2 –10%-ый раствор хлорида натрия. Они осаждаются 50%-ым раствором сульфата аммония. Белки семян бобовых и масличных культур в основном представлены глобулинами; легумин – гороха и чечевицы, фазеолин – фасоли; глицин – соевых бобов. Многие альбумины и глобулины обладают ферментативным действием.

Проламины. Эта группа белков характерна исключительно для семян злаков. Эти белки растворяются в 60-80%-ом растворе этилового спирта. Эти белки содержат значительные количества пролина и глютаминовой кислот. Лизина они не содержат или содержат его в следовых количествах. Хорошо изучены проламины пшеницы – глиадины, ячменя – гордеин, кукурузы – зеин. Проламины – это комплексы белков различающиеся по составу и молекулярной массе.

Глютелины находятся, как правило, с проламинами. Растворяются они в щелочах (чаще 0,2%-ым NaOH). Глютелины не однородные белки, а смеси разных белков со сходными свойствами. Наиболее исследованы глютелин пшеницы, орезенин риса.

Глютенин и глиадин пшеницы образуют комплекс, который называют клейковиной. Клейковина муки влияет на структурно-механические свойства теста, а, следовательно на качество хлеба.

Протамины – самые низкомолекулярные белки. Встречаются эти белки в молоках рыб. На 2/3 эти белки состоят из аргинина, поэтому имеют основной характер. Протамины не содержат серы.

Гистоны – содержаться в хромосомах клеточных ядер, они участвуют в стабилизации пространственной структуры ДНК. Гистоны на 20-30% состоят из основных аминокислот. Из растворов их осаждают аммиаком.

Протеноиды – подгруппа нерастворимых фибриллярных белков животного происхождения. К ним относятся фиброин – шелка, кератин – волос, рогов, перьев, сухожилий и связок. Характерная особенность протеноидов – высокое содержание в них серы. Эти белки не гидролизуются пищеварительными ферментами.

Протеиды – сложные белки, в которых белок связан с веществом небелковой природы – простетической группой. В зависимости от химической природы простетической группы их делят на липопротеины, гликопротеины, хромопротеины, нуклеопротеины, фосфопротеины, металлопротеины.

В липопротеинах простетическая группа представлена каким-либо липидом. Эти белки входят в состав клеточных мембран, участвуют в структурной организации миелиновых оболочек, нервной ткани, хлоропластов и т.д., а так же присутствуют в свободном состоянии.

Гликопротеины – в качестве простетической группы содержат углеводный компонент. Это могут быть глюкоза, монноза, N-ацетилглюкозамин, L-фукоза и т.д. Эти белки выполняют специфические функции: обеспечивают клеточную адгезию, молекулярное и клеточное узнавание, антигенную активность опухолевых клеток, оказывают защитное, гормональное, и антивирусное действие.

Типичные представители гликопротеинов – белки, входящие в состав слюны, а так же некоторых растительных слизей. Растительные гликопротеины называют еще лектинами. Некоторые лектины оказывают антипитательное действие – они нарушают процессы всасывания питательных веществ. Антипитательное действие лектинов фасоли твердо установлено.

Хромомпротеины – состоят из простого белка и связанного с ним окрашеного небелкового компонента. Среди хромопротеинов различают гемопротеины, содержащие в качестве простетической группы железо- или магнийпорфирины; флавопротеины – содержащие производные изоаллоксазина. Хромопротеины участвуют в таких функциональных процессах жизнедеятельности, как транспорт кислорода и углекислого газа, фотосинтез, окислительно-восстановительные реакции, свето- и цветовосприятие и т.д. К группе хромопротеинов относятся гемоглобин и его производные, хлорофилсодержащие белки, такие ферменты как каталаза и пероксидаза, сукцинатдегидрогеназа, все белки цитохромы.

Нуклеопротеины – одна из самых важных групп белков, состоящая из простых белков связанных с нуклеиновыми кислотами. Эти белки играют первостепенную роль в хранении и передаче генетической информации и биосинтезе белка и содержаться в основном в ядрах клеток. Дезоксирибонуклеопротеины содержат дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК). Рибонуклеопротеины содержат рибонуклеиновую кислоту (РНК)

Фосфопротеины – эти белки содержат органически связанный, лабильный фосфат, абсолютно необходимый для выполнения клеткой ряда биологических функций. Кроме того, они являются ценным источником энергетического и пластического материала в процессе роста и развития зародышей и молодого растущего организма. Наиболее изучены фосфопротеины – казеин молока, вителлин яичного желтка, ихтулин икры рыб. Металлопротеины наряду с белком содержат ионы какого-либо металла или нескольких металлов. Металлопротеины выполняют различные функции. Например, белок трансферрин (содержит железо) служит физиологическим переносчиком железа в организме. Другие металлопротеины являются биологическими катализаторами-ферментами – амилазы (содержат Са²⁺) гидролизуют крахмал, карбоангидроза (Zn²⁺) расщепляет угольную кислоту, аскорбинотоксидаза (Cu²⁺) разрушает витамин С и т.д.

2. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Нуклеиновые кислоты были открыты в 1868г. швейцарским врачом Ф. Мишером. Биологическая функция этого вещества оставалась неизвестной еще в течение почти столетия, и только в 40-х годах прошлого века Эвери, Маклеод и Маккарти установили, что нуклеиновые кислоты, отвечают за хранение, репликацию (воспроизведение), транскрипцию (передачу) и трансляцию (воспроизведение на белок) генетической (наследственной) информации. Короче, именно нуклеиновые кислоты определяют вид, форму, химический состав и функции живой клетки и всего организма в целом.

В 1953 г. Уотсон и Крик сообщили о расшифровке молекулярной структуры ДНК. В каждом живом организме присутствуют два типа нуклеиновых кислот: рибонуклеиновая кислота (РНК) и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). В то же время вирусы содержат только один какой-нибудь тип нуклеиновых кислот: либо РНК, либо ДНК.

Нуклеиновые кислоты – это высокомолекулярные соединения, размер которых сильно варьирует. Молярная масса транспортной РНК составляет 25000, тогда как отдельные молекулы ДНК обладают массой от 1 000 000 до 1 000 000 000.

Количественное содержание ДНК в клетках одного и того же организма постоянно и исчисляется несколькими пикограммами, однако в клетках разных видов живых организмов имеются существенные количественные различия в содержании ДНК. ДНК преимущественно сосредоточено в ядре, митохондриях и хлоропластах. РНК большей частью содержится в цитоплазме клеток. Содержание РНК, как правило, в 5-10 раз больше, чем ДНК. Соотношение РНК/ДНК в клетках тем выше, чем интенсивнее в них синтез белка.

Нуклеиновые кислоты обладают сильно выраженными кислотными свойствами и при физиологических значениях рН несут высокий отрицательный заряд. В связи с этим в клетках организмов они легко взаимодействуют с различными катионами и прежде всего с основными белками, образуя нуклеопротеины.

1. Состав нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты при полном их гидролизе распадаются на три типа веществ – азотистые основания (пуриновые и пиримидиновые основания), сахара (пентозы) и фосфорную кислоту.

Пентозы нуклеиновых кислот представлены D-рибозой или 2-D-дезоксирибозой. Оба эти сахара содержатся в составе нуклеиновых кислот в фуранозной форме и имеют -конфигурацию:

Нуклеиновая кислота называется рибонуклеиновой (РНК), если в ее состав входит рибоза, или дезоксирибонуклеиновой (ДНК), если в ее состав входит дезоксирибоза. Недавно установлено, что рибоза и дезоксирибоза не являются единственными углеводами, входящими в состав нуклеиновых кислот: в ряде фаговых ДНК и РНК некоторых видов раковых клеток найдена глюкоза.

Азотистые основания, которые обычно встречаются в нуклеиновых кислотах – это производные пурина аденин ( А) и гуанин (G)-и производные пиримидина – цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U). Сами пурин и пиримидин в состав нуклеиновых кислот не входят.

Строение основных азотистых оснований-компонентов нуклеиновых кислот:

Цитозин, аденин, гуанин содержатся в нуклеиновых кислотах обоих типов, урацил входит только в состав РНК, а тимин в ДНК.

Для гуанина, цитозина, тимина и урацила известна кето-енольная таутомерия, однако кетоструктуры гораздо более стабильны и доминируют при физиологических условиях.

Таутомерия

В нуклеиновых кислотах все оксосодержащие азотистые основания присутствуют в кетоформе.

В составе ДНК и РНК встречаются так называемые необычные или «минорные» азотистые основания. К ним относятся, например, 5-метилцитозин, 4-тиоурацил, дигидроурацил и др.

5- метилцитозин - тиоурацил дигидроурацил

( в ДНК) ( в тРНК) (в тРНК)

Рассмотренные пуриновые и пиримидиновые основания, а так же некоторые другие производные пурина и пиримидина, которые не входят в состав нуклеиновых кислот, часто содержатся в растениях в значительном количестве в свободном состоянии. Наиболее часто в свободном состоянии в растениях встречаются гипоксантин (6-гидроксиоксипурин), найденный в семенах горчицы и люпина. Ксантин (2,6-дигидроксиоксипурин) и аллонтоин очень широко распространены в растениях. В форме этих оснований, как и в форме амидов аминокислот, происходит запасание и транспорт азота в растениях.

гипоксантин ксантин аллантоин

Пурины и пиримидины поглощают электромагнитную энергию в ультрафиолетовом (УФ) диапазоне, причем каждое соединение имеет характеристический спектр поглощения, однако для всех этих соединений максимум поглощения наблюдается вблизи 260 нм. Нуклеиновые кислоты так же поглощают в УФ-области. На этом свойстве основаны методы количественного определения нуклеиновых кислот.

В процессе обмена веществ у животных и растений пуриновые основания образуют такие продукты, как мочевая кислота, кофеин, теобромин, последние используются как лекарства.

1. Нуклеозиды

Азотистое основание с присоединенным к нему углеводным остатком, называют нуклеозидом. В нуклеозидах ковалентная связь образована С¹-атом сахара и N¹- атомом пиримидина или N⁹- атомом пурина, такая связь называется гликозидной. Что бы избежать путаницы в нумерации, атомы углеводной части отличают штрихом. Для наиболее распространенных нуклеозидов приняты тривиальные названия: аденозин, гуанозин, уридин и цитидин. Дезоксирибонуклеозиды называются дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезоксицитидин и тимидин.

Например:

Пиримидиновый Пуриновый

рибонуклеозид дезоксирибонуклеозид

Нуклеозиды являются фрагментом структуры нуклеотидов; однако многие нуклеозиды встречаются в свободном состоянии. Некоторые из них обладают лечебными свойствами. Различные микроорганизмы выделяют арабинозилцитозин и арабинозиладенин, в состав которых входит -D-арабиноза вместо рибозы. Эти вещества используются в качестве мощных антивирусных и антигрибковых агентов и против некоторых видов рака. Механизм действия ara-А и ara-С основан на ингибирование биосинтеза ДНК.

1. Нуклеотиды

Нуклеотиды – это фосфорные эфиры нуклеозидов. В образовании связи участвует 5¹-углеродный атом пентозы. В зависимости от строения пентозы все нуклеотиды можно разделить на рибонуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды.

В зависимости от числа имеющихся остатков фосфорной кислоты различают нуклеозидмонофосфаты, нуклеозиддифосфаты и нуклеозидтрифосфаты. Все эти три вида нуклеотидов постоянно присутствуют в клетках.

Рисунок 3 – моно-, ди- и трифосфонуклеотиды (5¹) аденозина.

Названия отдельных нуклеотидов часто обозначают сокращенно большими первыми буквами названий соответствующих оснований. Ниже приведены нуклеотиды, входящие в состав нуклеиновых кислот, и даны их условные сокращенные обозначения.

Таблица 2 – Сокращенные названия отдельных нуклеотидов

Нуклеотиды – это сильные кислоты, так как остаток фосфорной кислоты, входящий в их состав, сильно ионизирован.