94419 (Чутливість деяких патогенних мікроорганізмів до антибіотиків цефалоспоринів ІІІ покоління), страница 4

При визначенні чутливості оптимальним є використання чистої культури мікроорганізмів, яку виділяють до початку антибіотикотерапії. Але в екстрених випадках для отримання орієнтовних даних допускається використання для посіву патологічний матеріал: мокротиння, кал, гній, сеча, ексудат та ін. Після виділення чистої культури мікроорганізмів дослідження повторюють.

За чутливістю до лікувальних препаратів мікроорганізми поділяють на 3 групи: чутливі, помірно стійкі й стійкі.

До чутливих відносять ті штами мікроорганізмів, ріст яких пригнічується під дією препарату в концентрації, яка створюється в сироватці крові хворого в разі використання терапевтичних доз препарату.

До помірно стійких відносять штами мікроорганізмів, для пригнічення росту яких потрібна концентрація препарату, яку можна створити при введенні його максимально допустимих доз.

Стійкими вважають штами мікроорганізмів, ріст яких не пригнічується препаратом у концентраціях, які можна створити при використанні максимально допустимих доз.

У зв'язку з тим що ступінь чутливості мікроорганізмів, залежить від умов постановки досліду, то для отримання достовірних результатів необхідно використовувати паперові диски промислового виробництва, стандартні поживні середовища й чітко дотримуватися інструкції щодо проведення дослідження [27].

Диски з антибіотиками випускають у флаконах по (100 ± 5) штук. Диски гігроскопічні, тому у флакон вкладають силікагель — індикатор синього або блакитного кольору й шар гігроскопічної вати. За наявності вологи силікагель-індикатор змінює забарвлення до бузкового або рожевого. Диски з таких флаконів використовувати не можна. Зберігають флакони з дисками в сухому темному місці за температури не вищій ніж 10 °С. Термін зберігання вказано на етикетці. Перед використанням флакони з дисками витримують за кімнатної температури протягом 1 год.

Стандартні середовища використовують трьох типів. Середовища № 1 і № 2 подібні за складом: на 1000 мл поживного бульйону додають 15 г агару (в агарі не повинно бути надлишку Са²⁺і Mg²⁺), 3 г натрію гідрофосфату; після стерилізації рН 7,2—7,4. Ці середовища відрізняються між собою тим, що поживне середовище № 1 готують на поживному бульйоні Хоттінгера, а № 2 — на м`ясо-пептонному бульйоні (МПБ), розведеному фізіологічним розчином у відношенні 1:2.

Середовище № 3 — це сухе поживне середовище АГВ (сухе поживне середовище для визначення чутливості мікробів до антибіотиків). При його виготовленні користуються вказівками, що є на етикетці.

Для гемофільних мікроорганізмів у ці поживні середовища додають 5 % дефібринованої або гемолізованої крові. Середовище розливають по 20 мл у стерильні чашки Петрі (діаметр чашок 100 мм). Підготовлені чашки можна зберігати в холодильнику за температури 10 °С не більше ніж 7 діб. Перед посівом поверхню середовища підсушують за кімнатної температури, для цього їх витримують при злегка відкритій чашці протягом 30—40 хв.

Для посіву використовують 18—20-годинну агарову культуру бактерій або патологічний матеріал. При використанні агарової культури її спочатку змивають невеликою (4—5 мл) кількістю фізіологічного розчину натрію хлориду. Можна використати 18—20-годинну бульйонну культуру. Суспензію або бульйонну культуру розводять ізотонічним розчином натрію хлориду до густоти оптичного стандарту № 10 (1 млрд. мікроорганізмів на 1 мл суспензії), а при використанні середовища № 3 — до стандарту № 5 (500 млн. мікроорганізмів на 1 мл суспензії). Для цього суспензію чи бульйонну культуру стерильною піпеткою переносять у стерильну пробірку, яка за діаметром, товщиною стінок і кольором скла відповідає пробірці оптичного стандарту. Густоту інокулята порівнюють з густотою оптичного стандарту і в разі необхідності додають ізотонічний розчин натрію хлориду до потрібної густоти. Отриману мікробну суспензію (інокулят) розводять повторно ще в 10 разів тим самим ізотонічним розчином. Розведений інокулят в об'ємі 1—2 мл наносять піпеткою на поверхню середовища і, похитуючи чашку, рівномірно розподіляють по всій поверхні середовища; надлишок інокуляту переносять у дезінфікуючий розчин. Чашку знову підсушують за кімнатної температури протягом 10—15 хв.

За допомогою пінцета накладають диски на однаковій відстані один від одного і на відстані 2 см від краю чашки. На одну чашку — не більше 6 дисків [27].

Культивують мікроорганізми за температури 35—37 °С протягом 18—20 год.

Для контролю відтворення й точності результатів у випадку визначення чутливості при кожній постановці тесту паралельно зі штамами, які досліджуються, необхідно використовувати еталонні штами: Е. coli (ATCC 25922), S. aureus (ATCC 25923) і P. aeruginosa (ATCC 27853).

Якщо діаметри зон затримки росту еталонних штамів виходять за встановлені межі, то результати визначення чутливості будуть необ'єктивними й свідчитимуть про незадовільну якість середовищ, дисків або порушення методики постановки тесту.

Проведення посіву з метою визначення чутливості мікроорганізмів до хіміопрепаратів та антибіотиків методом дифузії в агар.

Під час роботи з живою культурою обов`язково дотримувались правил техніки безпеки!

Алгоритм "Проведення посіву з метою визначення чутливості мікроорганізмів до хіміопрепаратів та антибіотиків методом дифузії в агар"'.

поставити чашку Петрі з поживним середовищем із злегка відкритою кришкою для підсушування (на 30—40 хв), потім закрити чашку кришкою;

підготувати культуру мікроорганізмів (інокулят) до посіву;

підписати чашку Петрі (вказати назву середовища, номер аналізу, назву культури, дату посіву);

провести посів інокулята піпеткою на поживне середовище;

поставити чашку зі злегка відкритою кришкою для підсушування поверхні середовища (на 10—15 хв), потім закрити чашку кришкою;

поставити чашку донизу дном біля спиртівки;

взяти у праву руку пінцет, зафламбувати його;

взяти у ліву руку флакон з дисками, зняти з нього пробку мізинцем правої руки, зафламбувати отвір флакона;

взяти пінцетом один диск, зафламбувати отвір флакона, закрити його пробкою, поставити на стіл;

лівою рукою злегка підняти кришку чашки й покласти диск на поверхню середовища, придавити його злегка бланшами пінцета.

Чашку тримати біля полум'я на відстані не далі ніж 10 см. Пінцет фламбувати кожного разу перед тим, як узяти новий диск; при накладанні наступних дисків чашку обертати так, щоб зручно було накладати диски; дотримуватися вимог асептики [27];

накласти рівномірно інші диски;

поставити чашку в термостат догори дном.

Методика обліку результатів дослідження.

Для визначення результатів дослідження чашки ставлять догори дном на темну матову поверхню (облік у відбитому світлі) або тримають чашку проти джерела світла (облік у світлі, яке проходить крізь чашку). Лінійкою вимірюють діаметр зони затримання росту мікроорганізмів з точністю до 1 мм, включаючи діаметр дисків. Якщо в зоні затримання росту мікроорганізмів є колонії, то це свідчить про присутність сторонньої мікрофлори або гетерорезистентність окремих штамів даної культури.

Результати оцінюють за таблицею, яка знаходиться в упаковці з дисками. У таблиці зазначено межі значень діаметрів зон затримання росту мікроорганізмів для стійких, помірно стійких і чутливих штамів у міліметрах, а також значення мінімальних пригнічувальних концентрацій (МПК) антибіотиків у мікрограмах на мілілітр розчину для помірно стійких і чутливих штамів мікроорганізмів [23].

Одержані значення діаметрів зон затримання росту мікроорганізмів порівнюють із зазначеними в таблиці й відносять досліджувані штами до однієї з трьох категорій чутливості, а також визначають МПК. У відповіді вказують не розмір діаметрів зон затримання росту мікроорганізмів, а ступінь чутливості штаму мікроорганізмів до лікувальних препаратів та МПК.

2.3 Визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків методом серійних розведень

Цей метод можна виконувати із двох модифікаціях — на рідкому й на щільному поживному середовищі. Це точний кількісний метод. Його використовують у наукових дослідженнях і особливо важливих випадках у лабораторіях лікувальних і профілактичних закладів.

Для постановки досліду треба мати: чисту культуру мікроорганізмів, що досліджується, основний розчин антибіотика (32 ОД/см³), МПБ на переварі Хоттінгера, який містить 1,2— 1,4 г/дм³ амінного азоту.

Чисту культуру готували у вигляді мікробної суспензії. Для цього 18—20-годинну агарову культуру розводили ізотонічним розчином натрію хлориду до густоти оптичного стандарту № 10. Таким чином, отримали суспензію культури мікроорганізмів з концентрацією 10⁹ клітин у 1 мл її. Потім у дві пробірки наливали по 9,9 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. У 1-шу пробірку вносили 1 мл суспензії культури мікроорганізмів, розведеної до 10⁹ клітин в 1 мл, перемішували, отримали суспензію 10⁷ клітин в 1 мл. Потім 1 мл суспензії 10⁷ клітин в 1 мл переносили у 2-гу пробірку, перемішували, отримали культуру 10⁵ клітин в 1 мл. Розводили антибіотик з основного його розчину (табл. 2.1).

Таблиця 2.1

Отримання основного розчину антибіотика

2.4 Проведення посіву з метою визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотика методом розведення на рідкому поживному середовищі

Алгоритм "Проведення посіву з метою визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотика методом розведення на рідкому поживному середовищі":

виготовити мікробну суспензію 10⁵ мікробних клітин в 1 мл;

приготувати основний розчин антибіотика;

поставити в штатив 12 стерильних пробірок;

підписати пробірки: 1 — номер аналізу, номер пробірки й кількість антибіотика — 16 ОД. На всіх останніх пробірках — порядковий номер пробірки (2, 3... 10) і кількість антибіотика (8 ОД, 4 ОД і т. д.); на пробірці № 11 — "КК" (контроль культури); на пробірці № 12 — КС (контроль середовища);

внести в усі 12 пробірок по 1 мл МПБ;

внести у 1-шу пробірку 1 мл основного розчину антибіотика (32 ОД/мл), перемішати;

перенести 1 мл рідини з 1-ї пробірки в 2-гу, перемішати; 1 мл перенести з 2-ої пробірки в 3-тю й т. д. до пробірки № 10;

вилити 1 мл рідини з 10-ї пробірки в банку з дезінфекційним розчином;

Кожний інгредієнт беруть окремою піпеткою. У всіх пробірках повинен бути однаковий об'єм рідини [27];

внести у пробірки № 1 — 11 по 1 мл культури, що досліджується, у розведенні 100 000 клітин в 1 мл (10⁵ клітин в 1 мл);

штатив з пробірками поставити в термостат на 18—24 год. (температура — 37 °С).

Методика визначення результатів дослідження.

Результати починають визначати з контрольних пробірок. В 11-й пробірці "КК" повинен бути ріст культури (помутніння середовища), у пробірці "КС" середовище повинне бути прозорим. Потім розглядають дослідні пробірки. Відзначають останню пробірку, в якій середовище залишається прозорим. Кількість антибіотика в цій пробірці і є його мінімальною дозою, здатною пригнічувати ріст мікроорганізмів. У відповіді вказують мінімальну концентрацію антибіотика, що пригнічує ріст мікроорганізмів.

Проведення посіву з метою визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків методом серійних розведень на щільному поживному середовищі.

Алгоритм "Визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків методом серійних розведень на щільному поживному середовищі":

виготовити мікробну суспензію 10⁷ мікробних клітин в 1 мл;

виготовити з основного розчину двократне розведення антибіотика в 10 пробірках [23];

поставити в штатив 10 пробірок, в яких міститься по 9,9 мл розплавленого й охолодженого до 45 °С МПА; пронумеруйте їх від 1 до 10,11-та пробірка — контроль середовища;

поставити перед штативом 11 стерильних порожніх чашок Петрі, підписати на кожній чашці номер аналізу, порядковий номер і кількість антибіотика (16 ОД, 8 ОД 4 ОД і т.д.); на 11-й чашці - "КС";