94307 (Хіміко-токсикологічне дослідження лікарського препарату "Тетлонг-250"), страница 5

Для дослідження було використано готові пластинки "Силуфол-UV-254" з готовим закріпленим шаром силікагелю в суміші з люмінісцентним індикатором. Хроматографування проводилось в камерах висотою 20 см і діаметром 10 см, які заповнювались і насичувались 1 год. парами елуента такого складу: метанол, етанол, триетаноламін (1: 1: 0,3). На умовну лінію старту пластинки, що знаходилась на відстані 2 см від її нижнього краю, наносили з допомогою капілярів по дві краплі етанольно-водних розчинів: чистого дисульфіраму, а через 1,5 см (на умовній лінії старту) окремо розчини утворених комплексних сполук дисульфіраму з металами, наведеними в таблиці 1. Пластинку підсушували на повітрі і опускали вертикально в камеру для хроматографування, слідкували, щоб фронт елуента не досяг верхнього краю пластинки менше 1 см. Опісля її виймали з камери і ще вологою розглядали в УФ-світлі. На вологій хроматограмі відразу виявлялась пляма темно-сірого кольору дисульфіраму з Rf = 0,91, а плями відповідних "його комплексів з металами" виявлялись лише на висушеній пластинці після довгого ( 5 хв) прямого насвітлення її УФ променями з відповідними величинами Rf, наведеними в таблиці 1.

Таким чином, з допомогою методу ХТШС нами виявлено і доведено, що безпосередньо дисульфірам не утворює сполук з катіонами металів, а лише його метаболіт - диетилдитіокарбамінат, який має інше значення Rf в порівнянні з дисульфірамом. Однак, сам диетилдитіокарбамінат на хроматографічній пластинці в УФ-світлі, на відміну від дисульфіраму, виявляється у вигляді плям з слабкою рожево-фіолетовою флуоресценцією.

2.3 Кількісне визначення "Тетлонгу-250" фотоколориметричним методом

2.3.1 Наукове обґрунтування і розробка методу

Сучасний рівень розвитку науки вимагає використання високочутливих методів аналізу, які дозволяють визначати мікрокількості досліджуваних речовин. Тому широкого застосування набули оптичні методи аналізу, які базуються на взаємодії променевої енергії з аналізуючою речовиною. До цих методів належать фотометричні методи (спектрофотометрія і фотоелектроколориметрія).

Метод спектрофотометрії базується на вибірковому вбиранні монохроматичного випромінювання у видимій, ультрафіолетовій та інфрачервоній ділянках спектру. Вибірковий характер вбирання світла залежить від природи речовини, що дозволяє проводити її якісний і кількісний аналіз.

Цей метод також використовується у фармації, зокрема у фармацевтичному та в хіміко-токсикологічному аналізах, оскільки в ньому повністю реалізується закон Бугера-Ламберта-Бера [3, 4, 5, 7, 15, 22, 40, 48, 56].

В своїх дослідженнях ми також користувались цим методом, але відтепер фотоелектроколориметри є майже в усіх дослідних лабораторіях, бо в десятки разів дешевші за спектрофотометри, а за можливостями і точністю майже не уступають останнім та мають значні переваги за простотою користування.

Тому нами розроблено надійний фотоелектроколориметричний метод кількісного визначення пролонгу "Тетлонг-250" в поєднанні з ХТШС у біологічному матеріалі. Дослідження полягає у відповідній підготовці проби біологічного матеріалу (крові, сечі або органів трупа) стосовно вимог та обробці хроматограм з метою ізоляції метаболіту від залишку димексиду, який гальмує (нами досліджено!) утворення диетилдитіокарбамінатного комплексу з паладієм.

З цією метою органи трупа подрібнюють, а кров або сечу розводять водою удвоє, і екстрагують диетилдитіокарбамінат разом із залишком дисульфіраму сумішкою хлороформу з етанолом (5:

1) 5 разів по 10 мл. Витяжки з окремого біоматеріалу об’єднують, промивають таким самим об’ємом води і центрифугують. Нижній шар відділяють і випаровують на водному огрівнику досуха; залишок при слабкому нагріванні розчиняють в 3-4 мл етанолу, концентрують і кількісно переносять на старт хроматографічної пластинки [51, 52].

При відпрацюванні методики нами виявлено інгібуючу дію на оптичну густину утвореного комплексу слідів димексиду в досліджуваній пробі.

Для попередження цього явища пластинки після хроматографування підсушують спочатку на повітрі, а потім у вакуумному ексикаторі не менше 6 год. і таким чином позбуваються всіх слідів димексиду. Опісля плями з диетилдитіокарбамінатом знімають, екстрагують нагарячо етанолом (3 рази по 1,5 мл), фільтрують, доводять етанолом об’єм до 4,9 мл і додають 0,1 мл 0,5% етанолового розчину PdCl₂, перідично збовтують протягом 30 хв. Через 30 хв. реакція комплексоутворення досягає найбільшої стабільності (протягом 20 хв) по оптичній густині D (перевіряють за еталонами-свідками), яку й вимірюють при світлофільтрі з λ = 315 нм з товщиною шару в 0,5 см напроти чистого етанолу (5 мл) з реактивом (0,1 мл 0,5% етанолового розчину PdCl₂, що служить розчином порівняння.

2.3.2 Побудова калібрувального графіка

Для визначення кількості дисульфіраму за його метаболітом попередньо будують калібрувальний графік залежності оптичної густини D від концентрації препарату С в мкг/мл. З цією метою готують стандартний 30,8 мг% -й розчин диетилдитіокарбамінату натрію у воді, який еквівалентний 20 мг% -ій концентрації дисульфіраму (коефіцієнт перерахунку 1,54), тобто такий, що відповідає вмісту 200 мкг/мл дисульфіраму.

Для цього на аналітичних терезах відважують 30,8 мг диетилдитіокарбамінату натрію, кількісно переносять у мірну колбу об’ємом 100 мл і, розчиняючи його, доводять об’єм розчину до мітки. Перемішують. З цього розчину готують серію розведених розчинів для утворення комплексної сполуки з PdCl₂ в ряд мірних пробірок, відбираючи в них прокаліброваними градуйованими піпетками на 0,1 мл, 1 мл і 5 мл необхідні об’єми стандартного розчину, що відповідає певній концентрації дисульфіраму в мкг/мл: 0,025 мл (1 мкг/мл); 0,05 мл (2 мкг/мл); 0,1 мл (4 мкг/мл); 0,15 мл (6 мкг/мл); 0,25 мл (10 мкг/мл); 0,5 мл (20 мкг/мл); 0,75 мл (30 мкг/мл); 1,0 мл (40 мкг/мл); 1,25 мл (50 мкг/мл); 1,5 мл (60 мкг/мл); 1,75 мл (70 мкг/мл); 2,0 мл (80 мкг/мл); 2,25 мл (90 мкг/мл); 2,5 мл (100 мкг/мл); 2,85 мл (110 мкг/мл).

Опісля в кожну пробірку додають по 0,1 мл 0,5% водного розчину PdCl₂ і доводять загальний об’єм кожної пробірки до 5,0 мл етанолом. Пробірки закривають і періодично збовтують протягом 30 хв., після чого проводять вимірювання оптичної густини цих розчинів з допомогою фотоелектроколориметра "КФК-2" в кюветі 0,5 см при світлофільтрі з λ = 315 нм навпроти розчину порівняння, що містить 0,1 мл 0,5% розчину PdCl₂ в 5 мл спирту. Визначення D кожного розчину проводять тричі і беруть середнє значення, яке заносять в таблицю 2. За цими даними будують калібрувальний графік залежності оптичної густини D розчинів дисульфіраму від концентрації його в мкг/мл, представлений на рисунку 1. Дані таблиці і калібрувального графіка свідчать, що оптична густина D паладієвого комплексу диетилдитіокарбамінату підпорядковується закону Бугера-Ламберта-Бера в межах концентрацій від 1 до 100 мкг дисульфіраму в 1 мл розчину.

Таблиця 2

Залежність оптичної густини D калібрувальних розчинів диетилдитіокарбамінат. Pd²⁺ (в переведенні на дисульфірам) від концентрації "С" при λ = 315 нм в кюветі 0,5 см

2.4 Методика кількісного визначення „Тетлонгу-250" (дисульфіраму) в біологічних об‘єктах

Дослідження препарату ґрунтується на здатності його основного метаболіту - диетилдитіокарбамінату утворювати оптичні комплекси у водно-спиртових речовинах з Рd²⁺ і вимірювання їх оптичної густини в УФ-ділянці світла.

При відпрацюванні методики було перевірено також вплив слідів димексиду в пробі біологічного матеріалу (крові, сечі, органах трупа) на оптичну густину утвореного комплексу, оскільки димексид гальмує його утворення. Вимірювання оптичної густини всіх контрольних проб (без димексиду) свідчить про відсутність будь-якої суттєвої різниці в значеннях „D” (0,000-0,015) яка залежиться тільки від якості обробки хроматограм.

В результаті проведених експериментів встановлено, що вимірювання оптичної густини D водно-спиртових паладієвих комплексів диетилдитіокарбамінату необхідно проводити не раніше 30 хв. від початку реакції, тобто під час найбільшої стабільності утвореного комплексу.

2.4.1 Підготовка проби

а) весь об‘єм добової сечі розводять водою до подвійного об‘єму і в ділильній лійці екстрагують дисульфідам в формі його метаболіту - диетил дитіокарбамінату сумішкою хлороформу з етанолом (5:

1) 5 разів по 6 мл за методикою Farago A. чи Домара [12, 41, 61]. Витяжки об‘єднують і випаровують на водному огрівнику досуха.

б) пробу крові розводять водою до 100 мл і екстрагують діетиловим ефіром 5 разів по 6 мл методикою [60] аналогічно.

в) органи трупа подрібнюють і екстрагують 5 разів сумішкою хлороформу з етанолом (1:

1) по Стас-Отто, чи за методикою Farago А. [11, 59], періодично збовтуючи в ділильній лійці на протязі 2-х годин. Витяжки випаровують, а залишок розчиняють в 60⁰ спирті і видаляють жир, промиваючи його ефіром. Спиртовий залишок випаровують на водному огрівному досуха.

2.4.2 Опис методики

Сухий залишок після підготовки проби розчиняють при слабкому нагріванні в 3-4 мл етанолу, концентрують і кількісно переносять на старт хроматографічної пластинки. Поруч з пробою на відстані 2 см. від неї на лінію старту наносять свідок чистого препарату (дисульфіраму в спирті) і підсушують пластинку на повітрі. Хроматографують на пластинках “Silufol-UV-254" фірми “Kavalir", призначених для тонкошарової хроматографії, з допомогою елюенту: метанол, етанол, триетаноламін (1: 1: 0,03). На вологих хроматограмах в УФ-світлі відмічають пляму з рожево фіолетовою флуоресценцією навпроти свідка з Rf = 0,75.

Хроматограми підсушують спочатку на повітрі, а потім у вакуумі не менше 6 год. (доведено нами експериментально) і таким чином звільняються від слідів димексиду. Опісля відмічені плями з препаратом знімають, сорбент промивають гарячим етанолом 3 рази по 1,5 мл і відразу фільтрують. До розчину додають 0,1 мл 0,5% етанолового розчину PdCl₂, доводять загальний об‘єм до 5 мл етанолом в мірній пробірці і періодично збовтують протягом 35 хв. Опісля вимірюють оптичну густину „D” з допомогою ФЕКа при світлофільтрі з λ = 315±5 нм в кюветі з товщиною шару розчину в 0,5 см. навпроти чистого етанолу з реактивом (PdCl₂).

По отриманій оптичній густині „D” за попередньо збудованим калібрувальним графіком залежності „D” від концентрації „С_k ” дисульфіраму (див. вище) знаходять концентрацію препарату в 0,5 мл проби. Оскільки пробу біоматеріалу екстраговано всю зразу і зконцентровано її вміст в 5 мл етанолу, то розрахунок кількості препарату розраховують за формулою:

С_х = С_к · 10,де: „С_к" - концентрація препарату в мкг/мл, найдена за калібрувальним графіком за визначеною оптичною густиною „D” з допомогою ФЕКа.

Дані результатів дослідження залежності оптичної густини „D” від концентрації „С_к" препарату свідчать про підпорядкування законові Бугера-Ламберта-Бера в межах концентрацій 1-100 мкг/мл.

Методика може бути використана при дослідженні елімінації дисульфіраму з сечею в клінічних лабораторіях для контролю лікування препаратом „Тетлонг-250” для ін‘єкцій і дисульфірамом в таблетках, а також - в токсикологічних лабораторіях для встановлення можливих отруєнь при неконтрольованому прийомі дисульфіраму і алкоголю [29].

2.5 Дослідження елімінації препарату „Тетлонг-250” в білих щурів ри одноразовому внутрішньом‘язевому введенні

Експериментальне дослідження проводилось на 15 білих щурах обох статей малого тіла 180-200 г. В досліді було використано три групи тварин:

Контроль І - внутрішньом‘язеве введення димексиду (5 шт)

Контроль ІІ - інтактні тварини (5 шт)

Дослід - внутрішньом‘язове введення препарату „Тетлонг-250” (5 шт)