РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ТОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ ГЕНЕТИКИ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ

На правах рукописи

БРАГИНА

ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ НАСЛЕДСТВЕННОЙ КОМПОНЕНТЫ ПОДВЕРЖЕННОСТИ К БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ И ТУБЕРКУЛЕЗУ ПО ГЕНАМ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА КСЕНОБИОТИКОВ

03.00.15. – генетика

Диссертация

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

академик РАМН,

профессор В. П. Пузырев

ТОМСК-2005

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений 4

Введение 6

Глава 1. Обзор литературы 12

1.1. Ферментативная система биотрансформации ксенобиотиков 12

1.1.1. Cемейства ферментов I и II фаз метаболизма 12

1.1.2. Свойства ферментов метаболизма ксенобиотиков 14

1.1.3. Генетический полиморфизм ферментативной системы метаболизма ксенобиотиков 17

1.2. Молекулярно-генетические аспекты мультифакториальных заболеваний (бронхиальная астма и туберкулез) 21

1.3. Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и патология 37

Глава 2. Материал и методы исследования 48

2.1. Характеристика обследованных групп населения 48

2.1.1. Характеристика группы больных туберкулезом 48

2.1.2. Характеристика группы больных бронхиальной астмой 50

2.2. Характеристика методов исследования 52

2.2.1. Клинико-лабораторные методы исследования 52

2.2.2. Молекулярно-генетические методы исследования 54

2.2.3. Статистические методы анализа 57

Глава 3. Результаты и обсуждение 60

3.1. Полиморфизм генов глутатионовых S-трансфераз (GSTT1, GSTM1, GSTP1) и цитохромов Р450 (CYP2E1, CYP2C19) у жителей г. Томска 60

3.2. Оценка роли полиморфизма генов ферментов метаболизма ксенобиотиков в развитии бронхиальной астмы и туберкулеза 65

3.2.1. Ассоциация полиморфных вариантов генов GSTT1, GSTM1, GSTP1, CYP2E1 и CYP2C19 с атопической бронхиальной астмой 65

3.2.2. Ассоциация полиморфизма генов ферментов метаболизма ксенобиотиков с туберкулезом 70

3.2.3. Сравнительный анализ роли полиморфных вариантов генов ферментов метаболизма ксенобиотиков в детерминации бронхиальной астмы и туберкулеза 76

3.3. Анализ ассоциаций генов ферментов метаболизма ксенобиотиков с бронхиальной астмой и туберкулезом на семейном материале 78

3.4. Оценка связи комбинаций генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с туберкулезом и бронхиальной астмой 81

3.5. Связь полиморфизма генов ферментов метаболизма ксенобиотиков с изменчивостью количественных признаков у больных бронхиальной астмой и туберкулезом 85

Заключение 101

Выводы 107

Литература 109

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

95% CI – 95% доверительный интервал;

CYP – гены цитохрома Р450;

GST – глутатион S-трансфераза;

GSTT1 (θ1) – глутатион S-трансфераза тета 1;

GSTT1+ - гомо- и гетерозиготы гена GSTT1;

GSTМ1 (μ1) - глутатион S-трансфераза мю 1;

GSTМ1+ - гомо- и гетерозиготы гена GSTМ1;

GSTР1 (π1) - глутатион S-трансфераза пи 1;

HLA – главный комплекс гистосовместимости человека;

Ig – иммуноглобулины;

IL1B – ген интерлейкина 1 В;

IL1RN – ген антагониста рецептора к интерлейкину 1;

INF-γ – гамма интерферон;

mEH – микросомальная эпоксигидролаза;

NAT2 – ген N-ацетилтрансферазы;

NRAMP1 (NRAMP1) – ген макрофагального белка (макрофагальный белок), ассоциированного с естественной резистентностью;

OR (Odds ratio) – отношение шансов;

P450 – цитохромы Р450;

S.D. – стандартное отклонение;

S.E. – стандартная ошибка;

TDT (Transmission/Disequilibrium Test) – тест на неравновесие по сцеплению;

TNFА – ген фактора некроза опухолей;

VDR – ген рецептора к витамину D;

АБП – антибактериальные препараты;

АЛТ – аланинаминотрасфераза;

АСТ – аспартатаминотрансфераза;

БА – бронхиальная астма;

БГР (BHR) – бронхиальная гиперреактивность;

ИЛ – интерлейкин (ы);

МБТ (M. tuberculosis) – микобактерия туберкулеза;

ОМЛ – острая миелоидная лейкемия;

ОФВ₁ (FEV1) – объем форсированного выдоха за первую секунду;

ПСВ (PEF)– пиковая скорость выдоха;

РС₂₀ – наличие бронхиальной гиперреактивности, установленное с помощью ингаляционного провокационного теста с метахолином;

РЛ – рак легкого;

РРП – рак ротовой полости;

РХФ – равновесие Харди-Вайнберга;

САП – скарификационные аллергопробы;

ТБ – туберкулез;

ФВД – функции внешнего дыхания;

ФЖЕЛ (FVC) – форсированная жизненная емкость;

ФМК/ФБК – ферменты метаболизма/биотрансформации ксенобиотиков.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Генетика широко распространенных болезней человека является активно развивающейся областью исследований. Однако темп накопления сведений о конкретных генах, участвующих в их возникновении и развитии существенно уступает известным на сегодня знаниям по генетике моногенных (менделевских) болезней. Еще более скромные успехи отмечены в изучении генетических основ подверженности к инфекционным заболеваниям. В последнем случае преобладают исследования, касающиеся изучения генетических характеристик возбудителей болезней, их геномов в формировании восприимчивости (устойчивости) человека к конкретной инфекции и клинического полиморфизма болезни. Наряду с этим направлением – изучение генома самого человека, контактирующего с инфекцией, заболевшего или сохранившего здоровье - становится важной областью генетических исследований [Пузырев и др., 2002; Frodshem, Hill, 2004]. Заметим, что отечественным генетиком А.С. Серебровским (1939) было высказано положение, обозначенное им как противоречие «единства бесконечного числа признаков и конечного числа генов», нашедшее, спустя более полувека, развитие в геномных исследованиях человека и обсуждение проектов «Феном человека» [Freimer, Sabatti, 2003] и «Феном мыши» [Paigen, Eppig, 2000]. «Важное различие между геномом и феномом состоит в том, что в то время как геном ограничен (приблизительно 3 млрд. пар оснований у человека), феном – нет (его предел зависит от того, как далеко мы хотим двигаться)» - эта мысль, сформулированная K. Paigen и J.T. Eppig (2000) тождественна положению А.С. Серебровского (1939). Подмеченное сходство взглядов классика генетики XX века и современных исследователей генома человека на гено-фенотипические взаимоотношения [Пузырев, 2001] является, по нашему мнению, обоснованием перспективности высказываемых и ранее гипотез о том, что клинически различные группы (нозологии) заболеваний человека могут контролироваться общим набором генов подверженности [Becker et al., 1998].

С позиции изучения вклада «общих» генов в развитие различных болезней особую актуальность приобретает исследование системы генов метаболизма ксенобиотиков, поскольку ферментами этой системы осуществляется метаболизм не только большинства разнообразных по химической структуре экзогенных молекул, но и многочисленных эндогенных веществ, например, медиаторов воспаления. Система ферментов метаболизма ксенобиотиков представляет собой сформировавшийся в процессе эволюции механизм адаптации организма к воздействию токсичных экзогенных и эндогенных веществ. Предполагается, что различия в скорости деградации различных субстратов ферментами метаболизма могут лежать в основе неодинаковой восприимчивости к ряду заболеваний. Изучению участия генов этой системы в развитии онкопатологии, эндометриоза, бронхиальной астмы, хронической обструктивной болезни легких, инфекционных заболеваний посвящены многие работы отечественных и зарубежных авторов [Lin et al., 1998; Иващенко и др., 2001; Ляхович и др., 2000, 2002; Delfino et al., 2000; Вавилин и др., 2002; Rollinson et al., 2003; Бикмаева и др., 2004]. Очевидно, что генетические различия в регуляции, экспрессии и активности генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков являются решающими факторами в развитии болезни и позволяют рассматривать ее как важное звено в этиологии и патогенезе этих заболеваний.

Особое внимание исследователей привлекает участие ферментативной системы метаболизма в биотрансформации лекарственных препаратов [Nebert, 1997]. Изучение полиморфизма генов этой системы в различных популяциях, обусловливающего существование индивидуальных особенностей метаболизма лекарственных препаратов, проявляющихся различиями в эффективности терапии и наличием многообразных побочных эффектов медикаментозной нагрузки, являются достаточно перспективными в практическом применении.

Представляется перспективным проведение сравнительного анализа участия белков ферментов метаболизма ксенобиотиков в возникновении и развитии заболеваний, которые с одной стороны, часто сочетаются друг с другом у одного индивидуума (синтропии), с другой – редко или совсем не встречаются вместе (дистропии).

Туберкулез (ТБ) и бронхиальная астма (БА), являющиеся частой патологией народонаселения, по-видимому, относятся к дистропным заболеваниям. Так, эпидемиологическая парадигма свидетельствует о том, что риск развития атопической БА и ее различных клинических проявлений в течение жизни намного ниже у индивидов, перенесших ТБ в детском возрасте [Von Hertzen et al., 1999, Shirakawa et al., 1997]. Тем не менее, показано, что при БА и ТБ имеет место общая генетическая основа (гены системы HLA, интерлейкинов и их рецепторных антагонистов и др.), обусловленная функциональной значимостью продуктов экспрессии этих генов в инфекционно-аллергическом процессе [Sandford et al., 1996; Greenwod et al., 2000; Bellamy, 2000; Sengler et al., 2002].

Таким образом, изучение роли полиморфных вариантов генов системы метаболизма в развитии БА и ТБ актуально и предполагает исследование их связи с клиническими особенностями течения заболеваний для понимания механизмов взаимодействия в процессе реализации наследственной информации на уровне целостного организма.

Цель работы: Провести сравнительный анализ значения полиморфизма генов ферментов метаболизма ксенобиотиков в развитии бронхиальной астмы и туберкулеза легких, оценить их роль в формировании клинических проявлений данных заболеваний у жителей города Томска.

Задачи исследования:

1. Изучить распространенность частот полиморфных вариантов генов ферментов метаболизма ксенобиотиков (CYP2C19, CYP2E1, GSTT1, GSTM1 и GSTP1) в выборке здоровых индивидов.

2. Оценить связь полиморфизмов исследуемых генов с атопической бронхиальной астмой и туберкулезом легких.

3. Изучить связь полиморфных вариантов, включенных в исследование генов, с клиническими особенностями течения бронхиальной астмы и туберкулеза легких, а также с патогенетически значимыми для этих заболеваний качественными и количественными признаками.

4. Провести сравнительный анализ роли полиморфных вариантов генов системы метаболизма ксенобиотиков в развитии бронхиальной астмы и туберкулеза.

Научная новизна:

Получены новые знания о роли генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (GSTT1, GSTM1, GSTP1, CYP2E1, CYP2C19) в развитии бронхиальной астмы и туберкулеза легких у жителей города Томска. Впервые проведена сравнительная оценка значимости исследуемых полиморфных вариантов генов системы метаболизма в развитии бронхолегочных патологий (на примере бронхиальной астмы и туберкулеза). Выявлены ассоциации полиморфизма генов GSTM1 (делеция) и CYP2E1 (7632T>A) с развитием бронхиальной астмы, а GSTP1 (313A>G) – с туберкулезом. Изучено влияние полиморфных вариантов генов системы метаболизма на развитие различных клинических особенностей течения заболеваний. Впервые проведена сравнительная оценка относительного риска в зависимости от комбинаций генотипов исследуемых генов для развития бронхиальной астмы и туберкулеза. Установлена роль генов глутатионовых S-трансфераз (GSTT1, GSTM1, GSTP1) и цитохромов Р450 (CYP2C19, CYP2E1) в детерминации изменчивости количественных, патогенетически значимых для заболеваний признаков. Показана связь полиморфного варианта 313A>G гена GSTP1 с изменчивостью уровня аланинаминотрансферазы у больных туберкулезом легких во время лечения антимикобактериальными препаратами.

Практическая значимость:

Полученные результаты исследования могут быть положены в основу разработки скрининговых программ по выявлению лиц с повышенным риском развития бронхиальной астмы и туберкулеза. Сведения о связи полиморфных вариантов генов ферментов метаболизма ксенобиотиков с изменчивостью показателей печеночной функции могут быть учтены при проведении профилактических мероприятий с целью предотвращения проявлений гепатотоксичности во время противотуберкулезной терапии. Материалы работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов. Полученная информация о полиморфизме генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у русских жителей города Томска может быть использована при проведении генетико-эпидемиологических исследований широко распространенных заболеваний.