94094 (Туберкулез: микробиологическая диагностика), страница 2

После посева и закрытия пробирок материал должен быть распределен по всей поверхности питательной среды, для этого пробирки наклоняют. Пробирки должны находиться в горизонтальном положении в течение 24–48 ч, после чего их следует перевести в вертикальное положение.

Посевы нужно просматривать еженедельно. При этом обязательно регистрируются параметры: а) появление роста – срок появления, начиная со дня посева; б) интенсивность роста – число колоний, этот показатель имеет большое диагностическое и прогностическое значение, особенно если посевы производятся в динамике; в) загрязнение посева посторонней микрофлорой или грибами; г) отсутствие роста.

При первичном посеве бактериоскопически отрицательного материала на плотные среды средняя продолжительность роста составляет 20–46 дней. Отдельные штаммы растут 60 и даже 90 дней. Это заставляет выдерживать посевы в термостате в течение 3 мес., еженедельно проверяя появление роста.

Обычно вирулентные культуры микобактерий туберкулеза растут на плотных питательных средах в виде R-форм колоний различной величины и вида. Колонии сухие, морщинистые, цвета слоновой кости, но в случае диссоциации могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии, розовато-желтый пигмент которых резко отличается от оранжевого или желтого пигмента сапрофитных или атипичных микобактерий. Последние обычно растут в S-форме. Следует отметить, что на среде Финна-II колонии микобактерий туберкулеза могут быть более влажными.

После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (S-формы). Гладкие колонии характерны также для Mycobacterium bovis, которые также патогенны для человека.

Положительный ответ дают только после микроскопии мазка из выросших колоний, окрашенного по Цилю–Нильсену. В мазках обнаруживаются ярко- и темно-красные палочки, лежащие одиночно или группами, образующие переплетения в виде «войлока» или «кос», часто видны темные зерна, особенно в длительно растущих культурах. В молодых культурах микобактерий туберкулеза (особенно выделенные от больных, длительно леченных химиопрепаратами) часто отличаются большим полиморфизмом, вплоть до появления коротких, почти кокковидных форм.

Интенсивность роста обозначают по 4-балльной системе: + единичные колонии; ++ от 20 до 100 колоний; +++ от 100 до 200 колоний; мм несосчитываемое число колоний (сливной рост). В двух последних случаях имеется обильное бактериовыделение, которое является показателем активности процесса и / или неэффективности лечения.

Если морфология колоний или палочек вызывает сомнения в их туберкулезной природе или культуры выделены из материала, который может содержать кислотоустойчивые сапрофиты (моча, гной из ушей и др.), мазки дополнительно обесцвечивают спиртом (в течение 45–60 мин) или жавелевой водой (в течение 1–2 ч). Следует учитывать, что молодые культуры микобактерий туберкулеза могут обесцвечиваться спиртом и жавелевой водой, так как они еще слабо кислотоустойчивы. В таких случаях культуры следует выдержать еще несколько дней (5–10) в термостате и вновь повторить микроскопическое исследование, чтобы убедиться в их кислотоустойчивости.

Авирулентные сапрофитные и атипичные микобактерий обычно грубее, толще, иногда менее интенсивно окрашены и, как правило, не образуют жгутообразных сплетений (корд-фактор отсутствует). Однако некоторые виды атипичных микобактерий (фотохромогенные) могут расти в R-форме. Многие атипичные и сапрофитные микобактерий имеют кислотоустойчивые зерна, весьма сходные с таковыми у вирулентных микобактерий туберкулеза.

В тех случаях, когда выделяются культуры, вызывающие сомнения в плане их принадлежности к микобактериям туберкулеза, их изучают, используя комплекс специальных исследований, позволяющих дифференцировать типичные микобактерий туберкулеза от нетуберкулезных (атипичных) микобактерий и кислотоустойчивых сапрофитов.

Как отмечалось выше, в случае появления на питательных средах роста колоний и установления с помощью микроскопии окрашенных по Цилю–Нильсену мазков факта, что выросшая культура относится к кислотоустойчивым микобактериям, производится количественная оценка результатов посева. С этой целью применяют различные схемы оценки (одна из них приведена выше). В Центральном НИИ туберкулеза используют количественную оценку бактериовыделения методом посева по 3 степеням: 1) скудное – на плотных питательных средах вырастает 1–20 колоний во всех пробирках, использованных для данного посева; 2) умеренное – от 21 до 100 колоний во всех пробирках; 3) обильное – обнаруживается рост более 100 колоний во всех пробирках.

Таксономическая характеристика – Четыре группы микобактерий

Первая группа – фотохромогенные микобактерии

Вырастают в темноте беспигментными (в термостате) в течение 3–6 недель, но после освещения дневным или электрическим светом приобретают пигмент желтого или желто-оранжевого цвета. К ним относятся: М. kansasii, М. simiае, М. balnеi. Наибольшее значение в легочной диагностике имеют М. kansasii.

М. kansasii (М. lucitlavum) выделены и описаны Булер и Поллак в 1953 г. как возбудитель заболеваний людей. На яичной среде растут в виде шероховатых или гладких колоний, температурный оптимум 37°С.

Морфологические бактерии умеренной длины. Описаны 2 варианта М. kansasii: оранжевый (auranticum) и белый (album). Отличаются они только способности образовывать пигмент, который зависит от наличия каротиноидов. Остальные свойства указанных вариантов – одинаковы.

При введении морским свинкам вызывают инфильтраты и уплотнения регионарных лимфоузлов. Встречаются в водоемах. Природный источник не установлен.

Вторая группа – скотохромогенные микобактерии

Образуют желто-оранжевый пигмент при росте в темноте, растут медленно 30–60 дней. К ним относятся М. aquae (М. gordonae), М. scrofulaceum.

М. scrofulaceum выделены Приссик, Массой (1958) из гноя лимфатического узла ребенка с лимфаденитом. На яичной среде растут в виде оранжевого цвета гладких или шероховатых колоний. Морфологически короткие или длинные палочковидные формы. Растут при 25–37°С. Вызывают у детей поражения лимфоузлов и легких.

М. aquae (М. gordonae, Tab-water scotochromogen – скотохромогены водопроводной воды). Выделены и описаны Бойялил с сотр. (1962). На яичной среде растут в виде оранжевых колоний при 25–37°С. Морфологически палочковидная форма умеренной длины (приблизительно 0,5 мкм). Обнаружены в водоемах. Для лабораторных животных не патогенны.

Третья группа нефотохромогенные микобактерии

Данные микобактерии не образующие пигмента или имеющие бледно-желтую окраску, которая не усиливается под воздействием света. Растут в течение 2–3-х или 5–6-ти недель. К ним относятся М. avium, М. xenopi, М. terrae, М. gastri, М. intracellulare, М. hattey, М. bruiiense. Последние описаны Куттино, Мак Кабе, Раньон (1965). М. avium дают рост на среде Левенштейна-Йенсена в виде пигментированных колоний при 37°С и 45°С. Морфологически – средней длины палочки. Патогенны для человека и для ряда лабораторных животных, а также для домашних животных (например, свиней). Встречаются в воде, в почве.

М. xenopi (М. littorale). Описаны Швабахер (1959). Выделены от жабы. Молодые культуры растут в виде непигментированных колоний; позднее появляется пигмент желтого цвета. Морфологически – длинные нитевидные палочки. Растут при 40°–45°С, патогенны для человека.

М. terrae (Radish bacillus) бациллы редьки. Описаны Вайном (1966). Растут на среде Левенштейна-Йенсена в виде бес пигментных колоний. Оптимум роста 37 °С. Морфологически – палочка умеренной длины. Чаще всего для человека не патогенна. Встречается в окружающей нас природе.

Четвертая группа – быстрорастущие микобактерии

Растут в виде пигментных или бес пигментных колоний, чаще в виде R-формы. Хороший рост дают в течение 2–5 дней при 25°С. К этой группе относятся потенциально патогенные микобактерии М. fortuitum и такие сапрофиты, как М. phlei, М. sniegmatis и др.

М. fortuitum (М. minetti, М. giae) выделены и описаны Круз (1933), Пенсо (1952). Рост в субкультурах на личной среде появляется на 2–4-й день в виде «розетки». Морфологически – короткие палочки. На среде Левенштейна–Йенсена могут поглощать краску и окрашиваться в зеленый цвет. Условно – патогенные для человека. Сапрофитные микобактерии широко распространены в природе.