94094 (Туберкулез: микробиологическая диагностика)

Эпидемическая ситуация по туберкулёзу в России

Эпидемическая ситуация по туберкулёзу в нашей стране осложнилась в начале 90-х годов. Численность впервые выявленных больных туберкулёзом по сравнению с 1990-м годом увеличилась к 2003 году более чем в 2 раза, в 1,5 раза возросла смертность по причине туберкулёза.

В структуре клинических форм стало больше пациентов, страдающих распространёнными, запущенными и осложнёнными формами, а так же больных, выделяющих лекарственно-устойчивые микобактерии туберкулёза, снизилась эффективность лечения больных туберкулёзом. При этом сохраняются резко выраженные различия в разных регионах страны, в первую очередь в отношении туберкулёза органов дыхания.

Основные мероприятия по реализации стратегии противотуберкулёзной помощи населению РФ определены под программой «Неотложные меры борьбы с туберкулёзом в России» федеральной целевой программы "Предупреждение и борьба с заболеваниями социального характера".

Токсическое воздействие микобактерий

В альвеолах пораженного участка легкого, помимо клеточных элементов, скапливается экссудат с большим содержанием фибрина. Токсическое воздействие микобактерий на окружающую их легочную и некоторые другие ткани столь велико, что в центре бугорка, как правило, образуется зона погибших клеток, зоны некроза, которые носят при туберкулезе казеозный (творожистый) характер.

В последующем на месте эпителиоидного бугорка развивается фиброзный рубец. Если казеозный некроз сохраняется, то вокруг очага развивается фиброзная капсула. Исследования последних лет показали, что в условиях раннего применения противотуберкулезных препаратов поражения в легких могут рассасываться с восстановлением нормальной легочной ткани.

При массовом инфицировании, в результате длительного контакта с бациллярным больным или при попадании микобактерий в ослабленный организм, в ткани легкого развивается воспалительный процесс с преобладанием экссудативной реакции и развитием участков специфической (туберкулезной) пневмонии, с выраженной наклонностью к творожистому некрозу и с последующими гнойным расплавлением омертвевших участков. Жидкий гной прорывается в близлежащий бронх. Вместо гноя в воспаленную ткань проникает из бронха воздух.

Так формируется полость в легком – каверна (от латинского cavium – пещера) или участок деструкции – разрушения. Образование каверны – переломный момент в жизни больного туберкулезом. При неблагоприятных условиях микобактерии, распространяясь из каверны по бронхам, вызывают поражение здоровых до того участков легочной ткани. Заболевание переходит в заключительную фазу – легочную чахотку (по-гречески – фтизу), которая и дала название медицинской специальности, изучающей туберкулез, – фтизиатрии.

В различные периоды развития туберкулезной инфекции преобладают либо клеточные элементы воспаления с последующим формированием фиброза, либо экссудативное воспаление пневмонических зон и участков распада.

Характеристика туберкулёзных бактерий

Туберкулезные бактерии подразделяются на три типа: humanus (человеческий), bovinus (бычий), avium (птичий). Туберкулезные бактерии типа humanus тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 2,5–3,5 µ, толщиной 0,3 µ.

Они отличаются значительным полиморфизмом: встречаются палочки длиной до и больше, а также со вздутиями на концах или же короткие, иногда в форме кислотоустойчивых зерен и кислотоподатливых зерен Муха.

Туберкулезная палочка может переходить в фильтрующиеся формы. Некоторые формы теряют кислотоустойчивость, но остаются грамположительными (зерна Муха и др.). Палочки типа bovinus в мазках из чистых культур короче и толще, чем бактерии типа humanus, а тип avium более полиморфен.

Туберкулезная бактерия – аэроб. Она растет на жидких средах в виде пленки по поверхности, при достаточном доступе кислорода. Она требовательна к питательным средам. Для культивирования применяют картофельные и яичные среды с глицерином, а также синтетические среды. На всех средах рост медленный, в течение 2–4 недель. Культура на плотной среде растет в виде сухих крупинок кремового цвета. Устойчивость туберкулезных бактерий особенно велика к высушиванию и действию дезинфицирующих веществ. Сухой жар (100°) они выносят в течение часа, но при воздействии прямых солнечных лучей быстро погибают. Находясь в мокроте, они остаются жизнеспособными при 60° в течение часа, но погибают при пятиминутном кипячении.

Туберкулезные палочки не выделяют экзотоксина. Белковая субстанция, получаемая в виде экстракта из убитых тел бактерий, носит название туберкулина. Зараженный организм проявляет повышенную чувствительность к туберкулину. Все типы туберкулезных бактерий патогенны для лабораторных животных, из которых наибольшей чувствительностью обладает морская свинка.

Техника люминесцентной микроскопии

Микроскопию проводят при увеличении 250х (например, увеличение объектива 25х, окуляра – 10х). Для детального изучения морфологии необходимо просмотреть их при увеличении 400х. Микобактерии окрашиваются в виде золотистых палочек.

Для детального изучения можно также применять иммерсионную систему. Для иммерсионных объективов используют не люменсцирующее вазелиновое масло. Предметные стекла должны быть без царапин. Для люминесцентной микроскопии используют люминесцентные микроскопы, при микроскопии достаточно просмотреть 30 полей зрения, в связи, с чем на каждый Мазок тратится значительно меньше времени.

Для микобактерий туберкулеза характерно золотисто-желтое свечение, в то время как, кислотоустойчивые сапрофиты при окраске смесью аурамина и родамина имеют свечение зеленоватого опенка. Ярко-красное свечение на зеленом фоне или золотисто-желтое – на темно-зеленом фоне характерно при окрашивании мазков по «Адамчику». Однако этот признак нельзя считать обязательным. Кислотоустойчивые сапрофиты отличаются большим полиморфизмом, поэтому следует учитывать и этот факт при бактериоскопии мочи и гной содержащего материала.

Количественная оценка результатов микроскопии

При просмотре мазков, окрашиваемых для люминесцентной микроскопии, как правило, используется меньшее увеличение (250–630), по сравнению с увеличением, используемым при просмотре мазков по методу Циль-Нельсена (1000). Таким образом, число кислотоустойчивых бактерий (КУБ), найденных при люминесцентной микроскопии мазка (увеличение 250), будет значительно больше, чем подобный результат мазка, полученный при окраски мазка по методу Циль-Нельсену (увеличение 1000). Увеличение рассчитывается методом умножения показателей величин окуляра и объектива.

Например: при микроскопии мазков, окрашенных по методу Циль-Нельсену увеличение составляет 1000 (объектив 100 и окуляр 10), при люминесцентной микроскопии 250 (объектив 25 и окуляр 10) чаще 280 (объектив 40, окуляр 7).

Чтобы избежать заблуждений, при выдаче положительных результатов, предлагается провести количественный пересчет, выявленных микобактерий в зависимости от использованного метод микроскопии и увеличения.

В последние годы довольно широкое распространение получил метод люминесцентной микроскопии. Он основан на различии свечения микроскопируемого объекта в ультрафиолетовом или коротковолновом спектре видимого света. В основе применения этого метода для дифференциации микобактерии туберкулеза лежит способность липидов этих бактерий воспринимать люминесцентные красители и затем светиться при облучении ультрафиолетовыми лучами. В зависимости от применяемых красителей микобактерии туберкулеза дают четкое ярко-красное свечение на зеленом фоне или золотисто-желтое – на темно-зеленом фоне. Этим методом можно исследовать любой материал, кроме мочи, в которой могут быть сапрофиты, трудно дифференцируемые при такой окраске. Последние имеют зеленоватый или апельсиновый оттенок. Наиболее широко распространены методы окраски акридиновым оранжевым по Адамчику и окраски аурамином-родамином.

При микроскопии мазков по люминесцентному методу высокая контрастность микроскопической картины дает возможность проводить исследования при малых увеличениях (объектив х40, окуляр х10). При такой микроскопической системе увеличивается одномоментно просматриваемое поле зрения (по сравнению с иммерсионной микроскопией). Это позволяет выявлять единичные микобактерии и делает люминесцентный метод особенно ценным при исследовании олигобациллярного материала. Люминесцентная микроскопия значительно сокращает время, затрачиваемое на нахождение единичных микобактерии туберкулеза, позволяет быстро просмотреть весь препарат и, следовательно, повысить число находок.

Окраска мазков по Цилю-Нильсену

Приготовленные, как описано выше, мазки покрывают фильтровальной бумагой и наносят 1,5–2,0 мл карболового фуксина па один мазок, затем медленно нагревают предметное стекло с мазком над пламенем горелки по появления пара.

При этом не допускают кипение фуксина и высушивание материала. Мазок с прогретым раствором оставляют на 5 минут. Затем удаляют фильтровальную бумагу и аккуратно смывают остатки краски со стекла проточной водой.

Обесцвечивание проводят 25% раствором серной кислоты (2 мл на мазок) в течение З минут. Затем стекло промывают проточной водой и дополнительно обрабатывают 96% этиловым спиртом (2 мл на мазок) в течение 5 минут. Гашение фона достигается обработкой 0,3% раствором метиленового синего в течение 30–60 секунд.

Приготовление растворов

(Все растворы готовятся с использованием дистиллированной воды)

1). Насыщенный спиртовой раствор фуксина: основной фуксин – 3 г растворяют в – 100 мл 96% этилового спирта.

2). Рабочий раствор фуксина: кристаллы фенола 5 г медленно нагревают до расплавления, доливают 90 мл воды, затем в полученный раствор фенола добавляют 10 мл насыщенного раствора фуксина.

3). 25% серная кислота: в 300 мл воды доливают 100 мл 98% (концентрированной) серной кислоты. Данная манипуляция проводится с крайней осторожностью!

4). 0,3% метиленовый синий: 0,3 г метиленового синего растворяют в 100 ил воды.

Для исследования окрашенных мазков используют бинокулярный микроскоп с иммерсионным объективом (х90 или х100 объектив, 7–10 окуляр). Исследуют не менее 100 микроскопических полей зрения в течение 5 минут. Ели МБТ не обнаружены, исследуют еще 100 полей зрения. Микобактерии выглядят как тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1–4 мкм и диаметром 0,2–0,5 мим, рубинового цвета, иногда с выраженной зернистостью.

Для культивирования микобактерии туберкулеза используют различные питательные среды: плотные, полужидкие, жидкие (синтетические и полусинтетические). Однако ни одна из них не обладает качествами, предъявляемыми к ним современной бактериологической диагностикой туберкулеза. В связи с этим для повышения результативности культурального метода рекомендуется применять посев патологического материала одновременно на несколько (2–3) питательных сред. Для выделения чистых культур микобактерии туберкулеза чаще всего применяют различные по составу плотные питательные среды. В качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя и определения его лекарственной чувствительности ВОЗ рекомендована среда Левенштейна – Йенсена. Это плотная яичная среда, на которой хороший рост микобактерии туберкулеза получают на 15–25-й день после посева бактериоскопически положительного материала.

В последние годы широкое распространение в нашей стране получила яичная среда II, предложенная Э.Р. Финном (среда Финна-II). Она отличается от среды Левенштейна – Йенсена тем, что вместо b-аспарагина в ней используется глутамат натрия. На этой среде рост микобайтерий туберкулеза появляется на несколько дней раньше, чем на среде Левенштейна – Йенсена. Процент выделения культур на этой среде на 6–8% выше, чем на среде Левенштейна – Йенсена.

Для повышения вероятности получения роста микобактерии рекомендуется засевать патологический материал на 2–3 различные по составу питательные среды одновременно. В настоящее время, кроме безаспарагиновой среды Финна-И, в практику внедряется еще одна безаспарагиновая среда, разработанная В.А. Аникиным. По данным Московского НИИ туберкулеза, применение сред, сбалансированных по солевому составу и источникам азотистого питания иначе, чем среда Левенштейна – Йенсена, культуральная диагностика туберкулеза улучшается в среднем на 6,7%. Это особенно важно при таких формах туберкулеза, при которых возбудитель паразитирует в условиях ацидоза и анаэробиоза, в частности, при туберкулезе мочеполовых органов.

Для повышения результативности культурального метода наряду с применением одновременно нескольких различных по составу питательных сред для посева рекомендуется повторное многократное исследование материала, так как в настоящее время отмечается состояние олигобациллярности у большинства больных даже со свежевыявленными деструктивными поражениями в легких. Олигоба-циллярность проявляется не только малым количеством возбудителей в диагностическом материале, но и транзиторностью, эпизодичностью их выделения. Поэтому часто посев даже на 3 различные питательные среды не обеспечивает полной информации о состоянии бактериовыделения.

Для повышения информативности культурального метода практикуется повторное многократное исследование материала от больных. По данным Центрального НИИ туберкулеза, методика 3-кратного первичного комплексного исследования бактериоскопическими и культуральными методами у впервые выявленных больных деструктивным туберкулезом легких дает дополнительно 3,4% положительных результатов, а у больных хроническим деструктивным туберкулезом, лечившихся до поступления в стационар, – 5,8% по сравнению с данными одноразового исследования. Однако, по данным ряда авторов, и 3-кратные посевы недостаточны для выявления истинной картины бактериовыделения. Так, установлено, что при обследовании нелечившихся больных максимальный прирост информации о бактериовыделении можно получить при 6-кратных повторных посевах материала, при этом количество положительных результатов возрастает на 36–37% по сравнению с данными 3-кратного посева. У больных после 3-месячного лечения ценность многократного исследования патологического материала методом посева возрастает и при 6-кратном исследовании показатель прироста положительных результатов может достигать 70%, а после 6 мес. лечения он возрастает до 82%.

Таким образом, кратность исследования и состав питательных сред имеют важное значение для культуральной диагностики туберкулеза.

В связи с тем что в процессе интенсивной химиотерапии происходит повреждение различных метаболических систем микробной клетки, ряд микроорганизмов в микобактериальной популяции утрачивает способность нормально развиваться на питательных средах. Отмечается снижение жизнеспособности микобактерий, что может проявляться отсутствием роста на общепринятых питательных средах, а также возникновением способности расти только на осмотически сбалансированных (полужидкие или даже жидкие) питательных средах. Так, по данным И.Р. До рожковой, в процессе интенсивной противотуберкулезной химиотерапии часть микобактериальной популяции, утрачивая способность расти на плотных питательных средах, в то же время приобретает свойство расти на полужидких питательных средах, образуя микроколонии в верхнем наиболее аэрируемом участке питательной среды. Эта потребность в повышенной аэрации четко проявляется также при культивировании микобактерий в жидких питательных средах с увеличенной аэрацией, которая достигается при культивировании посевов во вращающемся термостате (Н.М. Макаревич).