1625912753-9924f6a9b879d980d6ddf630afb8d4ef (Э1)
Описание файла
Документ из архива "Э1", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из 5 семестр, которые можно найти в файловом архиве НГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с НГУ, его также можно найти и в других разделах. .
Онлайн просмотр документа "1625912753-9924f6a9b879d980d6ddf630afb8d4ef"
Текст из документа "1625912753-9924f6a9b879d980d6ddf630afb8d4ef"
Э-1. Гель-электрофорез ДНК
Приборы и реактивы:
1) камера для электрофореза фирмы BioRad (США)
2) УФ-прозрачная гелевая рамка для заливки геля и проведения электрофореза
3) заливочный столик с резьбовым зажимом
4) гребенка толщиной 1 мм на 8 карманов
5) источник постоянного тока фирмы BioRad (США)
6) система гель-документации BioRad (США)
7) автоматические пипетки и носики на них
8) пробирки типа «Эппендорф»
9) агароза фирмы Кох-Лайт (Англия)
10) ДНК фага лямбда (концентрация ≈ 500 мкг/мл)
11) маркер ДНК лямбда / HindIII (концентрация ≈ 500 мкг/мл)
12) раствор этидия бромида – 5 мкг/мл
13) 0,002% раствор бромфенолого синего и 50 мМ ЭДТА в 50% глицерине
14) буфер для электрофореза (40 мМ трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0)
Экспериментальная часть
Приготовление 1% агарозного геля
-
0,5 г агарозы поместили в коническую колбу, добавили 50 мл буферного раствора для электрофореза и довели до кипения в микроволновой печи (≈1мин) до получения однородной массы. Остудили раствор до 50-60 0С.
-
Гелевую рамку поместили на заварочный столик и зажали при помощи зажимов. Аккуратно вывили в форму горячий раствор агарозы и сразу вставили вертикальную гребенку в пазы на гелевой рамке примерно в 2 см от начала геля – создание карманов для нанесения образцов на гель.
-
После затвердевания геля (20-30 мин) осторожно удалили гребенку, ослабили зажимы заливочного столика и перенесли гель вместе с гелевой рамкой в камеру для электрофореза так, чтобы «карманы» в будущей ДНК были вблизи «-».
-
Залили гель буферным раствором так, чтобы гель был покрыт раствором в 5 мм.
Приготовление образцов
-
Внесли в две пластиковые пробирки автоматической пипеткой по 30 мкл буферного раствора и по 10 мкл раствора бромфенолового синего.
-
В первую пробирку добавили 3 мкл раствора ДНК, во вторую – 4 мкл раствора маркера ДНК лямбда / HindIII, перемешали, «сбросили» раствор на дно пробирки внучную.
Проведение электрофореза
-
Микропипеткой по 10 мкл внесли ДНК в два кармана и по 10 мкл внесли в два кармана маркеры
-
Закрыли крышки камер для фореза. Подключили электроды к источнику постоянного тока, установили на приборе 85 В, включили напряжение.
-
Дождались, когда краситель пойдет 2/3 длины геля, отключили напряжение.
-
Осторожно в перчатках вынули гель вместе с краской и положили в пустую кювету отдельно гель. Залили раствор бромистого этидия.
-
Через 30 минут вынули гель. Гель отмыли дистиллированной водой
-
Поместили гель в систему документации для обнаружения полос ДНК и ее фрагментов. В программе провели сканирование геля и сохранили результаты
Результаты
Длина кольцевой молекулы ДНК = 48502 пар оснований
средняя масса нуклеотидов 345
lnU=1/m
7 сайтов рестрикции: | Длина участка | Масса фрагмента | Нормировка масс, | Скорость продвижения | Предполагаемая электрофореграмма |
23 130 | 23 130 | 7 979 850 | 185,04 | 1,000000289 | |
2 027 | 699 315 | 16,216 | 1,000003293 1,000002874 | ||
25 157 | |||||
2 322 | 801 090 | 18,576 | 1,000000709 1,000011834 | ||
27 479 | |||||
9 416 | 3 248 520 | 75,328 | 1,000053395 1,000001018 | ||
36 895 | |||||
564 | 194 580 | 4,512 | 1,00000153 1,000000289 | ||
37 459 | |||||
125 | 43 125 | 1 | 1,000003293 1,000002874 | ||
37 584 | |||||
6 557 | 2 262 165 | 52,456 | 1,000000709 1,000011834 | ||
44 141 | |||||
4 361 | 1 504 545 | 34 ,888 | 1,000053395 |
Полученная электрофореграмма | Обработанная электрофореграмма |
|
Бэнд ДНК и первый бэнд маркера, соответствующий длине 23 130, находятся на одном уровне, так как ДНК кольцевая релаксирована, что укорачивает ее.Релаксироанная ДНК продвигается быстрее в геле, чем линейная того же веса. Но ДНК в эксперименте имеет больше пар оснований, чем линейная у маркера, что компенсирует скорость прохождения, поэтому бэнды на одном уровне.
Фрагменты 564 и 125 не зарегистрированы на фото, что может быть связано с чувствительностью настройки, но, вероятно, эти участки перегнались и вышли из геля из-за их малого веса.