169362 (Экологические аспекты современной биотехнологии), страница 5

В первой фазе брожения принимают участие микроорганизмы, обладающие целлюлолитической, протеолитической, липолитической, сульфатвосстанавливающей, денитрифицирующей и други­ми видами активности. Состав доминирующей микрофлоры данной фазы зависит от состава микрофлоры поступающего в ме-тантенки субстрата, а также от химической природы деградиру-емых органических веществ. Количество аэробных и факульта­тивно анаэробных микроорганизмов в первой фазе брожения достигает 10⁶ кл/мл, содержание облигатных анаэробов на 2—3 порядка выше. Целлюлозоразрушающие анаэробные бактерии в метантенках могут накапливаться в количестве до 10⁶ кл/мл. Среди бактерий, разрушающих гемицеллюлозу, обнаружены штаммы Bacterioides ruminicola, Butyrivibrio fibriosolvens и др.

Протеолитические бактерии, используемые в промышленности относятся к роду Clostridium (28 штаммов из 43 выделенных), Peptococcus anaerobis (8 штаммов), к родам Bacterioides и Eubacterium (3 штамма), а также к родам, близким к Bifidobacterium. Общее количество микро­организмов, обладающих протеолитической активностью, в ме­тантенках достигает 10⁵ кл/мл. Отмечается, что до 50 % выде­ленных бактерий, участвующих в метановом брожении, образуют споры. Влияние микробиологического состава поступившего в ме-тантенк субстрата на микрофлору метанового брожения хорошо видно на примере анаэробного сбраживания стоков свиноферм, в культуральной жидкости которых обнаружено до 50 % энтеробактерий Е. coli и анаэробных стрептококков. В этом опыте пер­выми развивались бактерии, обладающие амилолитической активностью, а позднее — обладающие целлюлолитической и протеолитической активностями.

Существенная роль в процессах метанового брожения принадлежит ацетогенными и водородпродуцирующим бактериям. Эти бактерии, например Syntrophobacter wolinii, превращают пропионат в ацетат, СО2, если в среде одновременно при­сутствуют водородпотребляющие бактерии. Водород образуется при окислении NADH₂ с образованием NAD. Содержание водоро­да в среде зависит не только от ацетогенных бактерий, но и от водородпотребляющих метаногенов. Метаногенная система будет работать эффективно тогда, когда парциальное давление водоро­да будет низким. При этом условии углеродные соединения кон­вертируются в ацетат, СО2 и будут плохо накапливаться различные жирные кислоты. В условиях загрузки биореактора легкодеградируемым субстратом концентрация СО2 может увели­чиваться и в среде будут накапливаться пропионовая, масляная и другие органические кислоты.

В третьей фазе — метаногенной — участвуют метанобразующие бактерии. Эта группа анаэробных бактерий принадлежит к древнейшему царству живых существ — архибактериям. Строе­ние и метаболизм метанобразующих бактерий сильно отличаются от прокариот. Так, у метаногенов маленький геном — около '/з генома кишечной палочки. Исследования последних лет показа­ли, что последовательность нуклеотидов в РНК у метаногенов и у обычных бактерий существенно различаются. Энергию для роста эти бактерии получают при восстановлении наиболее окисленного соединения СО₂ до наиболее восстановленного СН₄. Предполагаемый путь автотрофной ассимиляции СО2 у Methano­bacterium thermoautotrophicum показан на рис. 3.

Таблица 8. Фазы метанового брожения

Группы бактерий, участвующие в процессе

Исходные вещества

Продукты

Биогидролиз полимеров и ацидогенез

Гидролитические ацетогенные

Комплекс оргашче- Высшие жирные кис-
ских веществ лоты

Ацетогенез и дегидрогенизация Водородпродуцирующие бактерии Высшие жирные кис- На, СО₂, СН₃СООН

Метанобразующие бактерии

Метаногенез

На, СО₂, СНзСООН

СН₄, СО₂

Г алактозо-КН_г

|Аспартат{

Оксал о ацетат

I

Малат Фумарат

Фактор

Сукцинат

ATP I

Сукцинил-СоА

(С0₂) 1 ^факт°Р 420_ВОСС а-кетоглутарат

Гексозофосфат

Триоэофосфат

АТР

Фосфоенолпирув ат

Пентоэофосфат

Рис. 3.

Предполагаемая схема автотрофной ассимиляции СО₂ у бакте­рий Methanobacterium thermoautotrophicum

После создания Хангейтом Р. Э. в 1985 г. упрощенной техники культивирования метанобразующих бактерий удалось выде­лить 30 видов метаногенов, принадлежащих к 14 родам и 6 семействам. Некоторые представители метанобразующих бактерий приведены в табл. 11.9. По форме клеток метаногены являются кокками или палочками различных размеров и подвижности. Некоторые представители Methanobacterium и особенно Methanothrix могут образовывать даже нитеобразные клетки. Строение клеточной стенки у метаногенов отличается от таковой у обычных бактерий.

В качестве субстрата многие метаногены потребляют формиат, который трансформируют в метан:

4HCOOH-CH₄+3CO₂+2H₂O

Таблица 9. Характеристика метанобразующих бактерий

Род и вид

Характеристика культуры

Субстрат

Methanobacterium

formicum

bryantii

thermoautotrophicum Methanobrevibacterium

ruminantium

smithi

orboriphilus Methanococcus

vannielii

voltae

thermoiithotrophicus

mazei

Methanomicrobium mobile

Methanobacterium cariaci marisnigri

Methanospirillum hunga-tei

Methanosarcina barken

Methanolhrix soehngenii

Methanothermus fervidus

Палочки от длинных до ни­теобразных; в клеточной стенке содержится псевдо­муреин

Комки, короткие палочки; в клеточной стенке содер­жится псевдомуреин

Подвижные нерегулярные небольшие кокки; в клеточ­ной стенке содержатся по­липептидные субъединицы

Подвижные короткие палоч­ки и нерегулярные под­вижные небольшие кокки; в клеточной стенке содер­жатся полипептидные субъ­единицы

Подвижные небольшие не­регулярные кокки; в клеточ­ной стенке содержатся по­липептидные субъединицы Подвижные палочки; в кле­точной стенке содержатся полипептиды

Нерегулярные кокки, сгруп­пированные в пакеты; в кле­точной стенке содержатся гетерополисахариды Палочки от длинных до ни­тей; в клеточной стенке не содержится муравьиная кислота

Неподвижные палочки; в клеточной стенке содержит­ся псевдомуреин

Водород и формиат

Водород

То же

Водород и формиат

То же

Водород

Водород и формиат То же

»

Водород, метанол, метил­амин, ацетат Водород и формиат

То же

Водород и формиат

Водород, ацетат, мета­нол, метиламин

Ацетат

Водород

При переработке различных коммунальных и промышленных стоков пищевых производств основным субстратом для метаногенов является ацетат, который также превращается в метан:

СН₃СООН -СН₄ + СО₂.

К этой группе метаногенов относятся Methanosarcina barkeri Methanococcus mazei, Methanothrix soengenii. При конверсии ацетата в метан с их помощью очень мало изменяется свобод­ная энергия субстрата (AG6 = —32 кДж), поэтому скорость их роста низка и их генерация длится не менее 10 сут.

Некоторые метаногены, как следует из таблицы 9, конвертируют в метан также метанол и метиламин:

4/3 СН₃СООН -СН₄ + ½ СО₂ + 2/3 H₂O.

4/3 СН₃NH₂ + 2/3 H₂O - СH₄ + 1/3 CO₂.

Метан при метановом брожении получается также из СО₂ и Н2, образующегося в результате деятельности в основном ацетогенных бактерий. Предполагаемая схема восстановления СО₂ до метана представлена на рис. 11.4. Согласно этой схеме перенос­чиками С] являются метаноптерин (МР) и 7,8-дигидрометанопте-рин (ДНМР) , коферменты F_A и М.

Количество газа, получаемого из 1 моля кислоты в процессе брожения, можно определить по уравнению Басвелла:

- + со₂ +

HS-CoM

с _nн_a0_b + ( „ - i

COOH-DHMP

t

НСО-МР

HS-CoM СН_гОН-8-СоМ

CH,-&-CoM

„ CoM*

Рис. 11.4. Предполагаемая схема восстановления СО2 в метан метаногенами

где п, a, b — число атомов углерода, водорода и кислорода в соответствующей кислоте при 30 °С и нормальном давлении.

С увеличением длины углеродной цепи кислоты увеличивается количество получаемого газа. Так, из 1 г муравьиной кислоты получается газа 540 мл, из 1 г уксусной — 823 мл, из 1 г масля­ной — 1055 мл, из 1 г капроновой — 1224 мл.

Исследования, проведенные экологами, показали, что при термофильном метановом сбраживании паточной барды спиртового производства с содержанием СВ 4,2 % при суточной замене 10 % среды из 1 объема ферментационной жидкости выделяется 22 объема газа. Общее содержание кислот в жидкой среде 2,5 %, в том числе муравьиной — 0,46 %, уксусной — 0,79 %, пропио-новой — 0,86 %, масляной — 0,39 %. Экспериментально установ­лено, что по скорости сбраживания органические кислоты рас­пределяются в следующем нарастающем порядке: пропионовая, капроновая, валериановая, муравьиная, масляная, уксусная. Наиболее интенсивно сбраживается уксусная кислота.

Метаногенез зависит в большой степени от химического со­става среды и физических факторов. Прежде всего необходимо иметь в виду, что метаногены строгие анаэробы и кислород является для них ядом. Значение окислительно-восстановительного потенциала (еН), при котором лимитируется рост метаноге-нов, равно 330 мВ; оптимум — примерно — 400 мВ. Присутствие одной молекулы О₂ в 10 л воды ингибирует метаногенез. Однако наши исследования показали, что кратковременная аэрация метантенка не приводит к гибели метаногенов, так как сопутствую­щая факультативно анаэробная микрофлора утилизирует кисло­род и через 2 сут метаногенез возобновляется (рис. 5).

Мета-нобразующие бактерии хорошо развиваются и метаболизируют субстрат в метан при рН 6—8. Однако различные представители по-разному реагируют на из-

РН

менение рН среды. В метан-тенках рН поддерживают на уровне, близком к нейтраль­ному или щелочному.

2 4 6 8 10 12 сут

Рис. 5. Влияние кратковременной аэра­ции среды на метаногенез при сбражива­нии свиного навоза в термофильных ус­ловиях

По температурному оп­тимуму различные метаноге­ны сильно различаются. В природе встречаются как психрофилы, так и термо­филы, выживающие даже при 97 °С. Большинство ме-тантенков работает в мезо-фильном режиме при 35— 45 °С. Термофильная фер­ментация (при 50—57 °С) идёт менее интенсивнее, чем мезофильная, однако процесс отличается меньшей стабильностью.

Биомасса метанобразующих бактерий состоит из 54 % углерода, 20 % кислорода, 10 % водорода, 12 % азота, 2 % фосфора и 1 % серы. Кроме того, в биомассе содержатся калий, натрий, кальций, магний и ряд микроэлементов, наиболее важные из ко­торых кобальт, молибден и никель. Чтобы обеспечить формиро­вание клеточной массы, в среде должны содержаться необходи­мые питательные вещества. Соотношение ХПК: N:P должно быть 700:5:1, нельзя допускать избытка азота (C:N не менее 20:1). Уровень токсичности ионов аммиака для метанобразующих бак­терий 1500—2000 мг/л; цианида (CN~) —0,5—1,0 мг/л; калия, натрия и кальция — 3000—6000 мг/л.

Ингибирование метаногенеза вызывают сульфиты, которые при метановом брожении сульфатвосстанавливающие бактерии восстанавливают до H₂S. Метаногенез ингибируется при концентрации сульфидов 100—159 мг/л. При метаногенезе на 50 % сокращается содержание растворимых солей тяжелых металлов при следующих концентрациях ионов (в мг/л}: железо— 1 —10; цинк— 10~⁴; кадмий— 10~⁷; медь —10~¹² и 10~¹ (для двухвалентной формы).