12935 (Определение интегральной антиоксидантной способности растительного сырья и пищевых продуктов)

Определение интегральной антиоксидантной способности растительного сырья и пищевых продуктов

Храпко Наталья Вячеславовна

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Краснодар 2006

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Кубанского государственного университета

Актуальность темы. Воздействие на человека неблагоприятных факторов окружающей среды, таких как УФ-излучение, радиация, загрязнения атмосферы и пищевых продуктов химическими соединениями приводит к образованию в организме избыточного количества свободных радикалов, тем самым вызывая дисбаланс в его антиоксидантном статусе.

Источниками антиоксидантов для человека могут служить пищевые продукты и напитки на основе растительного сырья, антиоксидантные свойства которых обусловлены такими биологически активными веществами как фенольные соединения, витамины, протеины, сахара, карбоновые и аминокислоты. Поэтому антиоксидантная активность (АОА) пищевых продуктов является одним из показателей, определяющих их биологическую ценность. Антиоксиданты также широко используются для предотвращения окислительной порчи жиров и жиросодержащих продуктов в процессе производства и хранения. Однако применение синтетических антиоксидантов ограничено из-за их возможного токсического действия. Это проводит к необходимости поиска альтернативных соединений в растительном сырье, обладающих высокой антиоксидантной активностью и безвредных для человека.

В настоящее время наиболее популярны методы оценки антиоксидантной активности, основанные на ингибировании окисления различных липидных субстратов с последующим определением продуктов окисления. Большинство этих методов, относящихся к данной группе, являются длительными и дают плохо воспроизводимые результаты, поэтому разработка новых методов определения, сочетающих экспрессность с достоверностью и высокой воспроизводимостью полученных данных, остаются актуальной задачей.

Настоящая работа выполнялась при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 03-03-96548, № 06-03-96616).

Цель работы. Исследование индикаторной системы Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин и разработка на её основе способа определения интегральной антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов.

В соответствие с целью исследования в работе поставлены следующие задачи:

теоретически обосновать и экспериментально доказать возможность использования индикаторной системы Fe(III)/Fe(II)–о-фенантролин для разработки спектрофотометрического способа оценки антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов;

исследовать влияние индивидуальных восстановителей органической природы и их смесей на индикаторную систему;

оценить суммарную антиоксидантную активность и провести сопоставительный анализ ее величины с известными суммарными характеристиками ряда пищевых продуктов и растительного сырья.

Научная новизна. Предложена и изучена индикаторная система Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин для оценки антиоксидантной активности пищевых продуктов и растительных материалов. Исследовано влияние восстановителей фенольной и нефенольной природы, присутствующих в пищевых продуктах, на индикаторную систему и показан суммарный характер измеряемой величины антиоксидантной активности.

Показана возможность использования величины суммарной антиоксидантной активности для характеристики качества пищевых продуктов и растительного сырья.

Практическая значимость. Предложен способ определения суммарной антиоксидантной активности пищевых продуктов и лекарственных препаратов на основе растительного сырья с использованием индикаторной системы Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин.

Проведена метрологическая аттестация методик определения антиоксидантной активности вин и лекарственных растений. Методика апробирована на образцах вина, пива, соков, чая, лекарственных трав и настоек.

На защиту выносятся

спектрофотометрический способ оценки интегральной (суммарной) антиоксидантной способности растительного сырья и пищевых продуктов на его основе;

результаты определения антиоксидантной способности индивидуальных восстановителей с учетом их химической структуры;

результаты анализа смесей восстановителей органической природы для оценки суммарного характера величины АОА;

результаты определения суммарной антиоксидантной способности некоторых пищевых продуктов для оценки их экологической безопасности и качества;

результаты исследований по влиянию экологической ситуации территории на величину антиоксидантной активности растительных материалов.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России 2004» (Москва, 2004 г.), II международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005 г.), заключительной конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «р2003юг» (Краснодар, 2005 г.), международном конгрессе по аналитической химии «ICAS – 2006» (Москва, 2006 г.), Всероссийской конференции молодых ученых и II школы им. Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2006 г.), международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и тезисы 6 докладов, получен патент РФ.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, приложения. Диссертационная работа изложена на 178 страницах, содержит 46 таблиц, 7 рисунков и библиографию из 170 наименований.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В литературном обзоре (глава 1) дана классификация и охарактеризованы основные группы антиоксидантов. Рассмотрены способы определения активности индивидуальных антиоксидантов и суммарной антиоксидантной способности растительного сырья и пищевых продуктов.

Во второй главе представлены данные об используемых методах и приборах, описаны условия эксперимента, изложены результаты с обсуждением.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Исследование системы Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин для оценки антиоксидантной способности природных объектов

Анализ литературных данных показал, что существующие в настоящее время методы определения антиоксидантной активности в большинстве случаев основаны на способности антиоксидантов взаимодействовать со свободными радикалами. Для оценки антиоксидантной активности индивидуальных веществ и реальных объектов обычно используют радикалы, образующиеся в процессе окисления липидсодержащих субстратов либо генерируемые в различных системах (Fe(III) – H2O2, гипоксантин – ксантин оксидаза, пероксидаза хрена – H2O2) радикалы OH˙, O˙ֿ2

Методы, основанные на ингибировании антиоксидантами окисления липидов, дают более достоверные результаты, поскольку характеризуют способность исследуемого объекта подавлять свободнорадикальные окислительные процессы в организме. Однако данные методы являются длительными и трудоемкими, а полученные результаты плохо воспроизводимы и зависят от многих параметров: природы окисляемого субстрата, концентрации инициатора, начальной скорости окисления.

Антиоксидантное действие большинства биологически активных соединений связано с их способностью легко окисляться, отдавая электрон или атом водорода, что положено в основу определения индивидуальных восстановителей по их воздействию на окислительно-восстановительную систему, содержащую комплексные соединения ионов переходных металлов: Fe(III) – 2, 2′ дипиридил, Fe(III) – трипиридил-триазин, Fe(III) – ферроцин, Cu(II) – неокупроин, Ru – 2, 2′ дипиридил.

Введение в окислительно-восстановительную систему Fe(III)/Fe(II) органического лиганда – о-фенантролина увеличивает величину стандартного редокс-потенциала полуреакции [Fe(Phen)3]+3 + ē [Fe(Phen)3]+2 до E° = 1,10 В, расширяя круг определяемых веществ. Следует также отметить, что способность органического лиганда образовывать с восстановленной формой железа устойчивый в широком диапазоне рН (2 – 9) окрашенный хелат со значительным молярным коэффициентом поглощения (ε = 11100) создает условия для высокочувствительного и селективного определения. Это позволяет использовать систему Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин для определения антиоксидантной способности биологически активных соединений.

Окислительно-восстановительная способность выбранной индикаторной системы и чувствительность определения зависят от количества и соотношения Fe(III) и о-фенантролина, которые целесообразно вводить в реакцию совместно в виде комплексного реагента.

Оптимизацию состава реагента проводили методом многофакторного планирования эксперимента, который позволил выделить и оценить эффект, вызываемый каждым изучаемым фактором в отдельности. Факторами выступали – концентрация Fe(III), о-фенантролина и объем реагента, вводимый в реакцию с восстановителем. В качестве восстановителя выбрана аскорбиновая кислота, ввиду ее высокого окислительно-восстановительного потенциала и возможного присутствия в предполагаемых объектах исследования. Границы варьирования уровней факторов определялись шириной диапазона линейности зависимости аналитического сигнала от концентрации аскорбиновой кислоты (0,05 – 2,0 мкг/см3), с одной стороны, и достаточной чувствительностью и устойчивостью аналитического сигнала во времени, с другой.

Для каждого состава реагента, по уравнениям регрессии, была рассчитана величина аналитического сигнала при концентрации аскорбиновой кислоты 1,2 мкг/см3 и подобран объем, при котором значение аналитического сигнала максимально. Дальнейшие расчеты позволили заключить, что оптимальным является реагент состава: 0,006 М Fe(III) – 0,01 М о-фенантролина, при его объеме, вводимом в реакцию 1,0 см3 на 100 см3 раствора.

Для доказательства суммарного характера определяемой величины АОА рассматривалось влияние восстановителей органической природы и их суммы на индикаторную систему.

Изучено влияние ряда индивидуальных восстановителей на систему Fe(III)–о-фенантролин оптимального состава. Для исследования выбраны широко распространенные в растительном сырье, материалах и используемые в пищевой промышленности антиоксиданты фенольной (галловая кислота, кверцетин, рутин, танин, гидрохинон) и нефенольной (аскорбиновая кислота, цистеин, глутатион) природы.

Аналитический сигнал для перечисленных органических соединений линейно зависит от концентрации вещества в широком диапазоне, но не стабилен во времени. Это приводит к увеличению зависимого коэффициента в уравнении регрессии при сохранении линейности в том же диапазоне (таблица 1). Величина тангенса угла наклона зависимости аналитического сигнала от концентрации восстановителя изменяется от 0,01 для глутатиона до 0,5 для галловой кислоты, что объясняется различной антиоксидантной способностью изучаемых восстановителей. По уменьшению антиоксидантной активности их можно расположить в следующей последовательности: галловая кислота > кверцетин > гидрохинон > аскорбиновая кислота > танин > рутин > цистеин > глутатион. Антиоксидантная активность обусловлена числом и расположением функциональных групп, способных легко отдавать атом водорода (–OH, –SH, –NH), наличием сопряженных двойных связей, а также пространственной структурой молекул. Так, кверцетин, который имеет две 3' и 4' гидроксильные группы в орто-положении кольца В и одну в 3 положении кольца С является более эффективным антиоксидантом, чем его гликозид рутин, активная 3 – OH группа которого замещена сахарным остатком (рутинозой). Кроме того, наличие гликозидного остатка приводит к изменению пространственного расположения молекулы, что также является причиной более низкой антиоксидантной способности гликозидов по сравнению с агликонами. Различие в восстановительной способности цистеина и трипептида глутатиона, по-видимому, также обусловлено пространственной структурой их молекул.

Таблица 1 – Зависимость аналитического сигнала от концентрации восстановителя во времени

Реальные объекты представляют собой довольно сложные по химическому составу системы, антиоксидантные свойства которых реализуются за счет суммарного содержания и действия восстановителей различной природы. Как правило, в растительных природных объектах и пищевых продуктах одновременно содержатся фенольные соединения, витамины, моно- и полисахариды, органические и аминокислоты. Кроме того, при оценке антиоксидантной способности необходимо учитывать не только природу и содержание восстановителей в исследуемом объекте, но и возможность их взаимного влияния (например, синергизм или антагонизм).