11519 (ДНК. Основы генетического материал), страница 2

Схема 2. Двойная спираль молекулы ДНК (модель Уотсона—Крика): А — аденин; Т — тимин, Г — гуанин; Ц — цитозин; Д — дсзоксирибоза; Ф — фосфат; 34 А — величина витка, спирали; 10 А — радиус спирали; 3, 4 А — расстояние между нуклеотидами; стрелки указывают направление витка спирали.

Схема 3. Соединение пуриновых и пиримидиновых оснований в молекуле ДНК (точками обозначены водородные связи).

У некоторых вирусов, например у бактериофагов Ф Х174, fd и М13, ДНК представлена одной полинуклеотидной цепью, замкнутой в кольцо и имеющей сравнительно небольшой мол. вес — 1,7-106. У большинства вирусов ДНК представляет собой двойную спираль, линейную пли замкнутую в кольцо; нередко такие формы переходят друг в друга, причем эти молекулы имеют так называемые «липкие концы», содержащие однонитчатые комплементарные друг другу нуклеотидные последовательности, при помощи которых молекула замыкается в кольцо. Для ДНК характерно сильное поглощение в ультрафиолетовой части спектра при длине волны около 260 нм. Удельное поглощение высокополимерной ДНК в растворе, содержащем выше 10-3 М NaCI, при рН 7,0 составляет около 6000 на 1 г-атом фосфора. ДНК сравнительно легко деполимеризуются под действием некоторых химических соединений, ультразвука, ионизирующей и ультрафиолетовой радиации; нагревание ДНК с разведенными минеральными кислотам приводит к отщеплению пуринов (аденина и гуанина) и образованию «апуриновой кислоты», содержащей только пиримидиновые основания. Нагревание растворов ДНК, а также их подщелачивание и т.п. вызывают денатурацию ДНК, заключающуюся в плавлении двойной спирали (разрыве водородных и гидрофобных связей) и расхождении полинуклеотидных цепочек. Денатурация сопровождается понижением вязкости раствора и повышением поглощения в ультрафиолете, по чему можно контролировать этот процесс. Температура плавления (температура, при которой денатурирована половина ДНК) тем выше, чем больший процент ГЦ-пар содержится в ДНК; этот показатель может служить для определения нуклеотидного состава ДНК. Установлено, что (не линейно связана с составом ДНК: 1° соответствует 2,5 молярным % ГЦ-пар. Гомогенные препараты ДНК (например, вирусной ДНК) характеризуются плавлением с резким переходом, тогда как гетерогенные препараты дают сравнительно широкую зону плавления, что может служить мерой гетерогенности ДНК. При быстром охлаждении после денатурации ДНК не восстанавливает своих нативных свойств, однако при медленном охлаждении полинуклеотидные цепочки реассоциируются по принципу комплементарности и таким образом происходит ренатурация молекул ДНК. При медленном охлаждении денатурированной ДНК в присутствии РНК полинуклеотидные нити ДНК и РНК могут ассоциироваться но принципу комплементарности пар гуанина с цитозином и аденина с урацилом (вместо тимина), образуя двунитчатые гибриды ДНК — РНК. Метод гибридизации широко применяется для исследования комплементарности и структуры двух типов нуклеиновых кислот, а также ДНК из разных источников. Изучение ренатурации ДНК показало, что ДНК высших организмов содержат повторяющиеся последовательности, которые можно разделить на очень часто повторяющиеся последовательности и относительно часто повторяющиеся. Кроме того, имеются и уникальные последовательности. К повторяющимся последовательностям, по-видимому, относятся регуляторные гены, а также гены, кодирующие рибосомные РНК, транспортные РНК и гистоны. Структурные гены, как правило, относятся к уникальным последовательностям, что доказано для таких активных генов, как гены глобина в эритробластах и гены фиброина в шелкоотделительной железе шелкопряда. У низших организмов (прокариотов) — вирусов и бактерий, а также в митохондриях ДНК не содержит или почти не содержит повторяющихся последовательностей. В ДНК ряда организмов обнаружены участки, в каждой из нуклеотидных цепей которых имеются последовательности оснований, повторяющиеся далее, но в обратном порядке. Поскольку такие последовательности читаются одинаково с обоих концов, как, например, слово «потоп», они получили название палиндромов. Палиндромы в ДНК и в синтезированных на их матрице РНК могут образовывать крестообразные структуры, физиологическую роль которых, возможно, связана с инициацией (началом) синтеза РНК или белков.

Методом молекулярной гибридизации показано, что в ядерной ДНК плодовой мушки Drosophila melanogaster около 75% всей ДНК представлено уникальными последовательностями, около 15% — очень часто (до 1 000 000 раз) повторяющимися и около 10% — относительно часто (1000—100 000 раз) повторяющимися нуклеотидными последовательностями. Очень часто повторяющиеся последовательности расположены главным образом в плотном хроматине, цитологически описываемом как гетерохроматин; они встречаются чаще всего в так называемой сателлитной ДНК, обычно отличающейся от основной массы ДНК по нуклеотидному составу и отделяемой от нее при равновесном центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия. Такие сателлиты содержатся почти у всех эукариотов и составляют от 1% до половины всей массы генома. Даже у близкородственных видов количество сателлитной ДНК может существенно отличаться. Относительно часто повторяющиеся последовательности распределены между гетеро- и эухроматином. Значительная часть дезоксирибонуклеопротеида хроматина состоит из чередующихся участков повторяющихся и уникальных последовательностей ДНК. Заметные количества ДНК, содержащей относительно часто повторяющиеся последовательности, находятся также в хроматине, ассоциированном с ядрышками и кодирующем рибосомные РНК.

Первичная структура ДНК трудно поддается изучению уже потому, что молекулы ДНК имеют огромные размеры. Некоторую информацию о последовательности нуклеотидов дает изучение пиримидиновых блоков. При обработке ДНК концентрированной муравьиной кислотой, содержащей дифениламин, происходит отщепление пуриновых оснований и дальнейший гидролиз ДНК. В молекуле сохраняются пиримидиновые последовательности, остающиеся в блоках, представляющих собой олигодезоксинуклеотиды, лишенные пуриновых мономеров. Такие блоки разделяют с помощью хроматографии на изоплиты — олигомеры, содержащие одинаковое число нуклеотидных остатков, затем их в свою очередь разделяют и анализируют. Подобным образом изучают пуриновые блоки, получаемые обработкой ДНК гидразином. Однако наибольший прогресс в изучении структуры ДНК достигнут в результате применения дезоксирибонуклеаз, расщепляющих определенные последовательности нуклеотидов, и в особенности рестриктаз, обладающих узкой специфичностью в отношении коротких нуклеотидных последовательностей в 6—7 нуклеотидов. Более детальную информацию в отношении нуклеотидной последовательности в молекулах ДНК, представляющих собой структурные гены, получают путем анализа нуклеотидной последовательности в соответствующих им РНК и белках. Удалось установить последовательность нуклеотидов в небольших молекулах сателлитной ДНК у высших организмов, выяснена также нуклеотидная последовательность в довольно значительных участках ДНК у некоторых вирусов, бактерий и др.

Метилирование азотистых оснований в составе ДНК происходит уже после синтеза молекулы и относится к так называемом постсинтетическим изменениям или модификациям.

У Е. coli метилируется аденин, находящийся как раз в той короткой последовательности нуклеотидов, которая «узнается» рестрикислотазой R1. По-видимому, рестриктазы избирательно разрушают чужеродные ДНК, попадающие в бактерию, в собственной же ДНК «узнаваемые» ими последовательности защищены метильными группами.

4. Методы количественного и качественного определения и исследования

Большинством цветных химических реакций ДНК обязаны своему углеводному компоненту — дезоксирибозе. Под действием кислот ДНК легко отщепляет пуриновые основания, причем освобождается альдегидная группа дезоксирибозы. В результате дальнейшего действия кислоты дезоксирибоза претерпевает превращения с образованием w-оксилевулинового альдегида: ответственного, по-видимому, за образование окраски с реактивами на ДНК.

Чаще других реакций для обнаружения и количественного определения ДНК применяют нагревание с дифениламином в концентрированной уксусной кислоте в присутствии концентрированной серной кислоты. Эту реакцию обычно применяют в модификации Бертона (К. Burton) при 30° в присутствии уксусного альдегида. Реже применяются менее чувствительные цветные реакции с цистеином, с триптофаном или индолом, а также с карбазолом. Иногда применяют также цветную реакцию с ганитрофенилгидразином. Весьма чувствительным является флюориметрический метод, позволяющий определять до 3.10-9 г ДНК.

Для количественного определения ДНК необходимо ее предварительное отделение от РНК и (по возможности) от других веществ, мешающих применяемой реакции. Для этих целей обычно пользуются методом Шмидта и Таннгаузера (G. Schmidt, S. J. Thannhauser) в различных модификациях. Принцип метода заключается в осаждении нуклеиновых кислот вместе с белками трихлоруксусной или хлорной кислотой, отмывании кислоторастворимых фосфорных соединений, экстрагировании липидов и извлечении нуклеиновых кислот при помощи гидролиза 5% трихлоруксусной кислотой при 90° в течение 15—20 мин. Белки при этом остаются в осадке; из раствора, содержащего нуклеиновые кислоты и подвергнутого гидролизу 0,3— 1,0 н. щелочью, вызывающей распад РНК до нуклеотидов, ДНК осаждают подкислением трихлоруксусной или хлорной кислотой. Осадок отмывают и ДНК экстрагируют горячей хлорной кислотой. Содержание ДНК определяют по фосфору, спектрофотометрически или при помощи специфических цветных реакций, но спекислотрофотометрический метод является наиболее простым и быстрым для определения ДНК после отделения ее от других веществ, характеризующихся максимумом поглощения при 260 нм.

При определении нуклеотидного состава ДНК последнюю подвергают гидролизу хлорной кислотой и отщепившиеся пуриновые и пиримидиновые основания разделяют хроматографией на бумаге или на ионообменниках. Хорошие результаты дает также хроматография в тонком слое на производных целлюлозы и др. Поскольку в обычных двуспиральных ДНК нуклеотидный состав подчиняется определенным правилам (правила Чаргаффа), он может быть выражен в виде процентного содержания ГЦ-пар. Молярный процент ГЦ-пар вычисляют, используя температуру плавления ДНК (температура, при которой денатурирована половина ДНК), по формуле: процент ГЦ-пар = 2,44 ((°пл — 69,3°). Коэффициенты, приведенные в формуле, рассчитаны эмпирически и варьируют в зависимости от ионной силы, ионного состава и величины рН раствора. Хорошие результаты при определении нуклеотидного состава ДНК дает метод улътрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Плавучая плотность ДНК при этом линейна связана с молярным содержанием ГЦ-пар (изменение содержания ГЦ-пар на 1% изменяет плавучую плотность на 0,001 единицы) и определяется по уравнению: молярное содержание ГЦ-пар = 10,2 .(р — 1,660), где р — плавучая плотность исследуемого препарата ДНК. Для чистых препаратов ДНК нуклеотидный состав можно определить также по спектру поглощения в 0,1 М уксусной кислоте по формуле, предложенной Фредериком (Е. Fredericq).

5. Содержание в клетках и тканях

Содержание ДНК в органах и тканях животных и человека колеблется в широких пределах и, как правило, тем выше, чем больше клеточных ядер приходится на единицу массы ткани. Особенно много ДНК (около 2,5% сырого веса) в вилочковой железе, состоящей главным образом из лимфоцитов с крупными ядрами. Довольно много ДНК в селезенке (0,7—0,9%), мало (0,05—0,08%) в мозге и мышцах, где ядерное вещество составляет значительно меньшую долю. На ранних стадиях эмбрионального развития в этих органах содержится больше ДНК, но содержание ее уменьшается в процессе онтогенеза по мере дифференцировки. Однако количество ДНК на одно клеточное ядро, содержащее диплоидный набор хромосом, практически постоянно для каждого биологического вида. Соответственно количество ДНК в ядрах половых клеток вдвое ниже. По этой же причине различные физиологические и патологические факторы почти не влияют на содержание ДНК в тканях, а при голодании, например, относительное содержание ДНК даже возрастает за счет снижения концентрации других веществ (белков, углеводов, липидов, РНК). У всех млекопитающих количество ДНК в диплоидном ядре почти одинаково и составляет около 6 1012 г, у птиц — около 2,5 10-12, у разных видов рыб, амфибий и простейших оно колеблется в значительных пределах.

Содержание ДНК в бактериях довольно велико и достигает нескольких процентов в пересчете на сухой вес; в вирусах оно может доходить до 50%. Вместе с тем абсолютное количество ДНК в бактериальной клетке в среднем на два порядка ниже, чем в клеточном ядре высших организмов, а в ДНК-содержащих вирусах оно ниже еще на два порядка.

У бактерий одна гигантская молекула ДНК образует генофор, соответствующий хромосоме высших организмов. Так, у кишечной палочки Escherichia coli молекулярный вес такой кольцеобразной двуспиральной молекулы достигает около 2,5-Ю9 и длины, превышающей 1,2 мм. Эта огромная молекула плотно упакована в небольшой «ядерной области» бактерии и соединена с бактериальной мембраной.