11301 (Биосинтез антител. Структура и специфичность антигенов), страница 2

Антигенная специфичность гаптенов зависит не только от их химической структуры, но и от способа пришивки к белку-носителю, в частности от того, какая функциональная группа гаптена была использована для конъюгирования. Часто, при получении конъюгатов для иммунизации гаптены пришивают не непосредственно к молекуле белка-носителя, а через пространственную «ножку», содержащую обычно 4—6 углеродных атомов. В этом случае сама «ножка» в комплексе с гаптеном выступает в качестве составной антигенной детерминанты и образующиеся антитела могут обладать меньшей эффективностью связывания с нативным гаптеном, чем с таким связанным через «ножку» гаптеном.

В некоторых видах иммуноферментного анализа в качестве одного из реагентов используют гаптен, меченный ферментом. Если связывание в таком конъюгате аналогично способу пришивки в конъюгате гаптена с белком-иосителем для получения антител, то говорят, что в анализе используют гомологичные антитела. Если же структура «ножки» и способ пришивки гаптена в обоих случаях различны, то говорят о гетерологичных антителах. Применение того или иного вида антител или конъюгатов в иммуноферментном анализе может весьма сильно сказываться на его чувствительности и некоторых других характеристиках.

Весьма существенным фактором для специфичности является химическая структура «нодаскы», в частности ее длина и ближайшее окружение гаптена. Все эти моменты крайне важно учитывать при разработке методов иммунохимического анализа гаптенов.

Сильное влияние различных факторов на антигенную структуру и специфичность гаптенов, по-видимому, объясняется их ограниченными размерами и особенностями структуры активных центров антител.

Знание антигенной структуры и специфичности гаптенов имеет важное значение для создания методов иммунохимического определения различных физиологически активных соединений, так как многие из них претерпевают различные биохимические превращения, в результате чего образуется группа близкородственных метаболитов.

3. Общая структурная характеристика молекул иммуноглобулинов

Антитела в организме выполняют две основные функции. Первая — это распознавание и специфическое связывание соответствующих антигенов, вторая — эффекторная, заключающаяся в индукции важнейших физиологических процессов, направленных на уничтожение антигена: лизис чужеродных клеток через активацию системы комплемента, стимуляция специализированных иммунокомпетентных клеток, выделение фармакологически активных веществ и т.д.

Развитие иммунохимии в течение последних 25 лет позволило установить строение антител, выявить стереохимические основы их функционирования. Особое внимание было уделено изучению структуры активных центров антител, что привело к созданию полицентровой модели связывания антигена. Исследования динамических структурных свойств иммуноглобулинов способствовало установлению характера связи между антигенсвязывающими и эффекторными функциями.

Иммуноглобулины по своей химической структуре относятся к большому классу природных соединений — гликопротеидам, высокомолекулярным соединениям, состоящим из последовательности L-аминокислот, соединенных между собой пептидными связями.

Отдельные аминокислоты отличаются между собой боковыми заместителями R. В состав белков, в том числе иммуноглобулинов, входят двадцать аминокислотных остатков.

Полипептидная цепочка за счет образования водородных связей между карбонильным атомом кислорода и атомом водорода аминогрупп отдельных аминокислотных остатков способна определенным образом укладываться в пространстве, образуя так называемые а-спиральные участки и структуру. Такая локальная упорядоченная конформация отдельных участков полипептидной цепи получила название вторичной структуры.

В целом вся полипептидная цепь образует компактную трехмерную структуру – третичную структуру: В одном растворе молекула белка сворачивается так, чтобы неполярные, или гидрофобные, боковые цепи аминокислотных остатков находились во внутренней, малодоступной для молекул воды области, а полярные, или ионизированные, группы образовывали внешний контактирующий с водой слой. Такое расположение аминокислотных остатков полипептидной цепи является термодинамическим наиболее выгодным состоянием, причем следует отметить, что это сворачивание пептидной цепи является высокоспецифичным и обусловлено первичной структурой молекулы.

Помимо рассмотренных причин сворачивания белков, обусловленных так называемыми гидрофобными взаимодействиями, определенный вклад в' стабилизацию трехмерной структуры вносят дисперсионные силы Лондона, возникающие в результате комплементарного распределения электронных облаков отдельных, рядом расположенных атомов. Энергия этого типа взаимодействий сильно зависит от расстояния между атомами и максимальна при так называемом ван-дер-ваальсовом расстоянии контакта, равном сумме ван-дер-ваальсовых радиусов взаимодействующих атомов.

Дополнительный вклад в поддержание трехмерной структуры молекул белков дают водородные и электростатические связи между боковыми группами аминокислот, а также ковалентные связи между отдельными частями полипептидной цепочки, например дисульфидные, или S—S-связи, возникающие между двумя остатками цистеина.

Некоторые молекулы белков состоят из несвязанных между собой ковалентно отдельных субъединиц. Такая пространственная организация получила название четвертичной структуры белков.

Несмотря на огромное разнообразие антител и их гетерогенность, все они обладают некоторыми общими структурными элементами, обеспечивающими выполнение их основных функций.

По своим антигенным, эффекторным свойствам и структурным особенностям иммуноглобулины подразделяются на пять основных классов: IgM, IgG, IgA, IgD и IgE.

Таблица 1 - Основные аминокислоты, входящие в состав белков

Общей структурной единицей всех иммуноглобулинов является комплекс из четырех полипептидных цепей — двух идентичных между собой легких цепей с молекулярной массой 23000 каждая и тяжелый с молекулярной массой по 53000.

Каждая из лёгких цепей прочно соединена с концевыми участками тяжелых цепей благодаря наличию межцепочечных ди-сульфидных связей и множеству слабых гидрофобных, электростатических и других межатомных взаимодействий. Аналогичные связи существуют и между свободными участками тяжелых цепей. В целом структура такого комплекса напоминает латинскую букву «V» или «Т» и характерна для иммуноглобулинов классов IgG, IgD и IgE.

При действии протеолитического фермента папаина молекула IgG распадается на три фрагмента, два из которых идентичны и сохраняют способность связывать антигены и третий, способный к кристаллизации. Именно Fc-фрагмент ответствен за эффекторную функцию антител — связывание белка комплемента Clq, транспорт через мембраны, взаимодействие с мембранными рецепторами и т.д.

Другой протеолитический фермент пепсин "разрывает пептидную связь, расположенную ближе к СООН-концу цепи, от S—S-связи между Н-цепями в Fc-фрагменте. В результате образуются так называемый pFc-фрагмент, представляющий собой остатки тяжелых цепей, и соединенные дисульфидными связями два Fа-фрагмента, обозначаемые как ¥2-фрагмент. Последний также сохраняет способность к связыванию антигенов.

Антигенсвязывающий центр расположен в Н2-концевых частях Н- и L-цепей. Таким образом, каждая молекула IgG, а также Р2-фрагменты содержат по два антигенсвязывающих центра, а Fab-фрагмент — один.

Необходимым условием для использования антител в иммуноферментном анализе является сохранение их способности специфически взаимодействовать с соответствующими антигенами.

Поэтому часто используют не целые молекулы антител, а только их фрагменты F2 или Fab, полностью сохраняющие эту способность. Такой подход позволяет в некоторых случаях устранить неспецифические реакции, обусловленные, в частности, взаимодействием Fc-фрагментов антител с поверхностями носителей.

Молекулы антител имеют большое число S—S-связей, которые можно разделить на 3 категории: межцепочечные связи, образуемые внутри структурной единицы между Н- и L-цепями и между Н- и Н-цепями, внутрицепочечные S—S-связи, возникающие в пределах одной и той же легкой или тяжелой цепи, и связи между Н-цепями отдельных четырехцепочечных комплексов, обусловливающих образование полимерных молекул — IgM и IgA.

Структура иммуноглобулинов различных классов обусловлена числом и расположением S—S-связей в молекулах, а также количеством четырехцепочечных элементов. На рис. 2 приведено схематическое изображение молекул иммуноглобулинов различных классов.

IgM присутствует в сыворотке в виде пентамера четырехцепочечных комплексов, соединенных S—S-связями между Н-цепями. Некоторое количество IgA сыворотки также присутствует в виде димерной и тетрамерной формы. Полимерные IgA и IgM содержат Небольшую полипептидную цепь с Мг=14 000—15000, которая, по-видимому, стабилизирует полимерную структуру. Кроме того, в димерный IgA входит секреторный компонент—большой гликопротеид с Мг=80 000.

Легкие цепи иммуноглобулинов бывают только двух типов —К или х. и являются общими для всех пяти классов, в то время как тяжелые цепи обладают структурными, иммунологическими и химическими особенностями, характерными для каждого класса иммуноглобулинов.

Для обозначения тяжелых цепей, относящихся к классам IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, используют соответствующие греческие буквы— у, ц, а, б и е. На основании различий в химическом строении Н-цепей в пределах класса можно выделить подклассы иммуноглобулинов: 4 — для IgG, 2 — для IgA и 2 — для IgM. В молекуле иммуноглобулина любого класса легкие цепи относятся только к одному типу.