Промышленная биотехнология

Технология ферментных препаратов

Производство ферментов при поверхностном культивировании продуцентов

При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и довольно прочно скрепляет твердые частицы субстрата, из которого получают питательные вещества. Поскольку для дыхания клетки используют кислород, то среда должна быть рыхлой, а слой культуры-продуцента небольшим.

Выращивание производственной культуры происходит обычно в асептических условиях, но среду и кюветы необходимо простерилизовать. Перед каждой новой загрузкой также необходима стерилизация оборудования.

Преимущества поверхностной культуры: значительно более высокая конечная концентрация фермента на единицу массу среды (при осахаривании крахмала 5 кг поверхностной культуры заменяют 100 кг культуральной жидкости), поверхностная культура относительно легко высушивается, легко переводится в товарную форму.

Посевной материал может быть трёх видов:

- культура, выросшая на твердой питательной среде;

- споровый материал;

- мицелиальная культура, выращенная глубинным способом.

В три этапа получают и посевную культуру. Сначала музейную культуру продуцента пересевают на 1 - 1.5 г увлажненных стерильных пшеничных отрубей в пробирку и выращивают в термостате до обильного спорообразования. Второй этап - аналогично, но в колбах, третий - в сосудах с 500 г среды.

Основу питательной среды составляют пшеничные отруби, как источник необходимых питательных и ростовых веществ. Кроме того, они создают необходимую структуру среды. Для повышения активности ферментов к отрубям можно добавлять свекловичный жом, соевый шрот, крахмал, растительные отходы. Стерилизуют среду острым паром при помешивании (температура - 105-140 С, время 60-90 минут). После этого среду засевают и раскладывают ровным слоем в стерильных кюветах. Кюветы помещают в растильные камеры. Культивируют в течение 36-48 часов.

Рост делится на три периода, примерно равных по времени. Сначала происходит набухание конидий и их прорастание (температура не ниже 28о С), затем рост мицелия в виде пушка серовато-белого цвета (необходимо выводить выделяемое тепло) и образование конидий. Для создания благоприятных условий роста и развития продуцента необходима аэрация и поддержание оптимальной влажности (55-70%).

Выросшая в неподвижном слое при поверхностном культивировании культура представляет корж из набухших частиц среды, плотно связанных сросшимся мицелием. Массу размельчают до гранул 5-5 мм. Культуру высушивают до 10-12% влажности при температурах не выше 40оС, не долее 30 минут. Иногда препарат применяют прямо в неочищенном виде - в кожевенной и спиртовой промышленности. В пищевой и особенно медицинской промышленности используются ферменты только высокой степени очистки.

Схема очистки сводится к следующему:

- освобождение от нерастворимых веществ;

- освобождение от сопутствующих растворимых веществ;

- фракционирование (как правило, хроматографическими методами).

Для выделения фермента из поверхностной культуры необходима экстракция. Как правило, экстраген - вода. При этом в раствор переходят сахара, продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения и очистки завершает сушка. После сушки препарат должен содержать не более 6-8% влаги, тогда он может в герметичной упаковке храниться до года без потери активности.

Стандартизация ферментного препарата - доводка активности фермента до стандартной, соответствующей требованиям ГОСТ. Для этого используются различные нейтральные наполнители - крахмал, лактоза и др.

Учитывая огромные перспективы применения ферментных препаратов в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине, можно сделать заключение о необходимости расширения исследований в этой области для оптимизации технологии и гарантийного получения высокоактивных и стабильных препаратов микробных ферментов.

Ферментные препараты

Ферментные препараты, высокоактивные катализаторы различных биохимических процессов. Различают ферментные препараты животного, растительного и микробного происхождения. По объему и ассортименту среди выпускаемых ферментных препаратов доминируют препараты, полученные путем микробиологического синтеза. Технология их производства основана на культивировании специально отобранных штаммов микроорганизмов — активных продуцентов ферментов, с последующим выделением препаратов. Наименование ферментных препаратов складывается из сокращенного названия основного фермента и видового названия продуцента. Препараты, полученные при поверхностном способе культивирования, имеют индекс П, при глубинном — Г. Индексом х обозначают степень концентрирования и очистки препарата в процессе выделения. Для интенсификации технологический процессов виноделия ферментная промышленность предлагает ряд комплексных препаратов грибного происхождения, различающихся по величине активности и соотношению гидролитических ферментных систем, оказывающих многообразное действие на высокомолекулярные вещества винограда и вина. При получении ординарных вин всех типов широкое применение получили пектолитические ферментные препараты — Пектаваморин П 10х и Г 10х, а также Пектофоетидин П 10х и Г 10х. Препараты стандартизуются по общей пектолитической активности; в качестве основных ферментов они содержат полигалактуроназу эндо- и экзодействия и пектинэстеразу, а в качестве сопутствующих — протеиназы, целлюлазы и гемицеллюлазы. Активность кислой протеиназы в препарате Пектофоетидин П 10х в 2 раза выше по сравнению с препаратом Пектаваморин П 10х. Оптимальные условия действия препаратов: рН 3,5—4,0, температура 35°—40°С. При получении крепленых, а также красных столовых виноматериалов ферментные препараты вносят в мезгу, при этом повышается общий выход сусла на 1—5%, а сусла-самотека на 10—20%, облегчается прессование, увеличивается содержание экстрактивных веществ и интенсивность окраски, ускоряются биохимические процессы, протекающие при созревании вин. При приготовлении белых столовых вин ферментные препараты вносят в сусло. Процесс осветления сусла ускоряется в 2—3 раза, количество гущевых осадков снижается на 4—5%. Пектолитические ферментные препараты могут быть использованы для обработки трудноосветляемых виноматериалов. При этом значительно сокращается расход оклеивающих веществ, повышается стабильность вин к помутнениям коллоидного характера.

С положительным технологическим результатом было апробировано применение опытных партий протеолитических ферментных препаратов — Протаваморина П 10х и Проторизина П 10х, катализирующих гидролиз белковых веществ сусла и вина, сопровождающийся накоплением пептидов и аминокислот. Разработан способ иммобилизации кислой протеиназы, выделенной из ферментных препаратов. Пектаваморин П 10х, позволивший многократно использовать фермент, повысить его стабильность к ингибирующему действию среды и создать непрерывный процесс обработки виноградного сока и вин с целью устранения помутнений белкового характера.

Активный комплекс ферментов целлюлолитического и гемицеллюлазного действия, обнаруженный в препаратах Цитороземин П 10х, Ксилонигрин П 10х, Целлолигнорин П 10х, Целлоконингин П 10х и Целлобранин П 10х, обеспечивает более глубокую степень мацерации растительной ткани при использовании вышеназванных ферментных препаратов по сравнению с пектолитическими ферментными препаратами. Использование целлюлолитических и пектолитических ферментных препаратов позволяет усовершенствовать технологию переработки сладких виноградных выжимок. При этом увеличивается выход спирта-сырца и снижается процент примесей в осадке виннокислой извести. Дозировки ферментных препаратов, зависящие от его активности, устанавливают пробной обработкой. Обычно используют суспензии ферментных препаратов концентрацией от 1 до 10%, которые готовят непосредственно перед внесением в обрабатываемый материал. Перспективы дальнейшего совершенствования приемов использования ферментативного катализа в виноделии связаны с созданием композиций высокоочищенных ферментов строго регламентированного состава, а также с получением иммобилизованных форм различных ферментных препаратов.

Источники

1. Датунашвили Е.Н. Применение ферментных препаратов в виноградном виноделии. — В кн.: Ферментные препараты в пищевой промышленности /Под ред. В.Л. Кретовича, В. Л. Яровенко. Москва, 1995;

2. Зинченко В.И. Применение цитолитнческого ферментного препарата в виноделии. — К., 1995; Калунянц К.А., Голгер Л.И. Микробные ферментные препараты: Технология и оборудование. — Москва, 2002;

3. Садыхов И.И. и др. Технологические и экономические аспекты переработки виноградных выжимок с использованием ферментных препаратов. — Виноделие и виноградарство СНГ, 1988; №4; Технологическая инструкция по применению пектопротеолитических ферментных препаратов при производстве виноградных вин. — В кн.: Сборник технологических инструкций, правил и нормативных материалов по винодельческой промышленности /Под ред. Г. Г. Валуйко, 6-е изд. 1985.

Биологическая очистка сточных вод. Немного теории

Краткая историческая справка

Еще в городах древнего Египта, Греции и Рима существовали канализационные системы, по которым  отходы жизнедеятельности людей и животных  транспортировались в водоемы - реки, озера и моря. В Древнем Риме перед сбросом в Тибр канализационные стоки накапливались и выдерживались в накопительном пруде-отстойнике - клоаке (cloaca maxima). В Средние века этот опыт был в значительной степени забыт, помои, экскременты людей и животных, выливались на городские улицы и удалялись эпизодически. Это являлось причиной загрязнения и заражения источников питьевой воды и приводило к возникновению эпидемий холеры, тифа, амебной дизентерии и др. В начале 19 века  в Англии был изобретен туалет с водяным смывом (water closet, WC). Возникла очевидная необходимость в обработке сточных вод и предотвращения их попадания в источники питьевой воды. Сточные воды собирали и выдерживали  в больших емкостях, осадок использовали в качестве удобрений. В начале двадцатого века были разработаны интенсивные системы  очистки бытовых сточных вод, включая поля орошения, где вода очищалась, фильтруясь через почву, струйные фильтры со щебневой и песчаной загрузкой, а также резервуары с принудительной аэрацией - аэротенки. Последние являются основным узлом современных станций аэробной очистки  городских сточных вод. Первоначально основной целью очистки стоков являлось их обеззараживание. Понимание важности качественной очистки сточных вод для охраны природных водоемов пришло позже. Проблема чистой воды является одной из актуальнейших проблем наступившего века. Для сохранения мест забора питьевой воды чистыми необходима качественная очистка сточных вод, производство которых в России достигает 500 литров в сутки на душу городского населения. В настоящее время разработаны и развиваются современные технологии очистки сточных вод. Наибольший интерес и перспективу имеют естественные и самые дешевые биологические методы очистки, представляющие собой интенсификацию природных процессов разложения органических соединений микроорганизмами в аэробных или анаэробных условиях.

Основные принципы биологической очистки воды

Очистка сточных вод подразумевает практически полное биологическое разложение органических соединений в воде. По существующим нормам, содержание органических веществ в очищенной воде не должно превышать 10 мг/л.

Деградация органических веществ микроорганизмами в аэробных и в анаэробных условиях осуществляется с разными энергетическими балансами суммарных реакций. При аэробном биоокислении глюкозы 59% энергии, содержащейся в ней, расходуется на прирост биомассы и 41% составляют тепловые потери. Этим обусловлен активный рост аэробных микроорганизмов. Чем выше концентрация органических веществ в обрабатываемых стоках, тем сильнее разогрев, выше скорость роста микробной биомассы и накопления избыточного активного ила. При анаэробной деградации глюкозы с образованием метана лишь 8% энергии расходуется на прирост биомассы, 3% составляют тепловые потери и 89% переходит в метан. Анаэробные микроорганизмы растут медленно и нуждаются в высокой концентрации субстрата.

Аэробный процесс

С₆Н₁₂О₆ +6О₂ --> 6СО₂ +6Н₂О + микробная биомасса + тепло

Анаэробный процесс

С₆Н₁₂О₆ --> 3СН₄ + 3СО₂ + микробная биомасса  + тепло

Аэробное микробное сообщество представлено разнообразными микроорганизмами, в основном бактериями, окисляющими различные органические вещества в большинстве случаев независимо друг от друга, хотя окисление некоторых веществ осуществляется путем соокисления (кометаболизм). Аэробное микробное сообщество активного ила систем аэробной очистки воды представлено исключительным биоразнообразием. В последние годы с помощью новых мокулярно-биологических методов, в частности специфических рРНК проб, в активном иле показано присутствие бактерий родов Paracoccus, Caulobacter, Hyphomicrobium, Nitrobacter, Acinetobacter, Sphaerotilus, Aeromonas, Pseudomonas, Cytophaga, Flavobacterium, Flexibacter, Halisomenobacter, Artrobacter, Corynebacterium, Microtrix, Nocardia, Rhodococcus, Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Staphylococcus. Считается, однако, что к настоящему времени идентифицировано не более 5% видов микроорганизмов, участвующих в аэробной очистке воды. Следует отметить, что многие аэробные бактерии являются факультативными анаэробами. Они могут расти в отсутствии кислорода за счет других акцепторов электрона (анаэробное дыхание) или брожения (субстратное фосфорилирование). Продуктами их жизнедеятельности являются углекислота, водород, органические кислоты и спирты.

Рис. 1.1. Сравнение материального и энергетического балансов методов аэробной и анаэробной очистки сточных вод.

Анаэробная деградация органических веществ, при метаногенезе осуществляется как многоступенчатый процесс, в котором необходимо участие по меньшей мере четырех групп микроорганизмов: гидролитиков, бродильщиков, ацетогенов и метаногенов. В анаэробном  сообществе между микроорганизмами существуют тесные и сложные взаимосвязи, имеющие аналогии в многоклеточных организмах, поскольку ввиду субстратной специфичности метаногенов, их развитие невозможно без трофической связи с бактериями предыдущих стадий. В свою очередь метановые археи, используя вещества, продуцируемые первичными анаэробами, определяют скорость реакций, осуществляемых этими бактериями. Ключевую роль в анаэробной деградации органических веществ до метана играют метановые археи родов Methanosarcina, Methanosaeta (Methanothrix), Мethanomicrobium  и другие. При их отсутствии или недостатке анаэробное разложение заканчивается на стадии кислотогенного и ацетогенного брожений, что приводит к накоплению  летучих жирных кислот, в основном масляной, пропионовой  и уксусной, снижениию рН и остановке  процесса.