На правах рукописи

МОСИН ОЛЕГ ВИКТОРОВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО

ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ, АМИНОКИСЛОТ И

НУКЛЕОЗИДОВ, МЕЧЕННЫХ 2Н (D) И 13С, С

ВЫСОКИМИ СТЕПЕНЯМИ ИЗОТОПНОГО

ОБОГАЩЕНИЯ.

03.00.23-Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской ордена Трудового Красного Знамени Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор, член корреспондент РАМН, В. И. ШВЕЦ, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Д. А. СКЛАДНЕЕ.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Н. Ф. МЯСОЕДОВ.

кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Б. М. ПОЛАНУЕР.

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ "ГОСНИИСИНТЕЗБЕЛОК".

Защита диссертации состоялась 24 мая 1996 г в 15.00 на

заседании Диссертационного совета Д 063. 41. 01 в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 1S7571, Москва, пр-т Вернадского, дом 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 119831, Москва, ул. Малая Пироговская, дом 1.

Автореферат разослан . апреля 1996 г

Учёный секретарь Диссертационного Совета,
Кандидат химических наук, старший научный сотрудник А. И. ЛЮТИК

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. В настоящее время во всем мире растет интерес к природным соединениям, меченным стабильными изотопами, в частности дейтерием ²Н (D) и углеродом ^|3С, которые незаменимы для разнопрофильных биохимических и диагностических целей, структурно-функциональных исследований, а также для изучения клеточного метаболизма разнообразных биологически активных соединений (БАС) с использованием стабильных изотопов. Тенденции к применению стабильных изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной и лазерной спектроскопией, масс-спектрометрией. Развитие этих методов за последние годы позволило усовершенствовать проведение многочисленных биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия клеточных БАС на молекулярном уровне. Зачастую для данных исследований необходимо, чтобы синтезируемые БАС имели как можно более высокие степени изотопного обогащения.

Именно поэтому разработка путей биосинтетического получения БАС с высокими степенями изотопного обогащения является очень актуальной задачей для современной биотехнологии и отечественной микробиологической промышленности. С развитием новых биотехнологических подходов появилась возможность получать разнообразные стабильно меченные соединения за счёт биологической конверсии дейтерированных субстратов дейтерометанола и тяжёлой воды CD₃OD/D₂O в генетически сконструированных штаммах бактерий. Однако подобные процессы редко применяются в биотехнологии из-за наличия ряда трудностей, связанных с клеточной адаптацией к тяжёлой воде (D₂O). Явление адаптации к тяжёлой воде интересно не только с научной точки зрения, но оно также позволяет получать уникальный биологический материал, очень удобный для решения задач молекулярной организации клетки с помощью метода ЯМР-спектроскопии. Эти данные послужили основой для выбора объектов исследования в наших экспериментах. Ими являлись генетически маркированные штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, относящиеся к различным таксономическим родам микроорганизмов: факультативные метилотрофные бактерии Brevibacterium meihylicurn, облигатные метилотрофные бактерии Methylobactllusflagettatum, галофильные бактерии Halobacterium halobium и бациллы Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens.

Настоящая работа выполнена на кафедре биотехнологии МГАТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках научно-технической программы "Наукоёмкие химические технологии ".

Целью данной работы была разработка методов биотехнологического получения аминокислот, белков и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода ¹³С с высокими степенями изотопного обогащения.

Поскольку биосинтетический потенциал исследуемых штаммов за счёт конверсии тяжёлой воды к началу проведения данной работы был изучен недостаточно, представляло интерес исследование принципиальной возможности их адаптации к росту на средах содержащих тяжёлую воду для синтеза меченных целевых продуктов. Для этого были применены специальные биотехнологические подходы по получению меченных БАС, что позволило подойти к реализации комплексного использования химических компонентов биомассы полученных штаммов-продуцентов и созданию новых безотходных микробиологических производств по получению изотопно-меченных БАС на их основе.

Научная новизна работы заключается в следующих аспектах:

1. Предложен метод получения штаммов-продуцентов БАС, устойчивых к максимальным концентрациям тяжёлой воды в ростовой среде.

2. Показана перспективность использования суммарных химических компонентов биомассы метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum, полученных в результате многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде для биосинтеза дейтерий-меченных аминокислот, белков и нуклеозидов.

3. Разработаны методы получения изотопно-меченных БАС, основанные на использовании высокоактивных штаммов-продуцентов, адаптированных к росту и биосинтезу на средах с высокими концентрациями тяжёлой воды. Получены с высокими
выходами индивидуальные дейтерий- и углерод-меченные ^|3С - аминокислоты (степени изотопноговключения составляют до 97,5%), [1,3',4',2,8-D5]-инозин (степень включения
дейтерия 62,5%) и дейтерий-меченный бактериородопсин с селективным и униформным характером включения метки.

4. Разработаны общие принципы масс-спектрометрического анализа степеней изотопного обогащения мультикомпонентных смесей аминокислот при данном способе введения метки за счёт применения прямой обработки (дериватизации) культуральной жидкости и белковых гидролизатов
дансилхлоридом/карбобензоксихлоридом и диазометаном.

Практическая значимость: Полученные в работе результаты могут быть использованы для создания новых безотходных производств по синтезу изотопно-меченных БАС. В частности, основанных на использовании биологической конверсии дешёвых меченных низкомолекулярных субстратов в дорогостоящие клеточные БАС.

На способ получения униформно-меченного дейтерием L-Phe имеется положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче авторского свидетельства № 055610 от 17.11.1995 г на заявку № 930558240 от 15.12.1993 г. На способ получения [1, 2',4¹,2,8-D5]-инозина оформлена заявка № 95118778 от 14.11.1995 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Подбор условий получения биомассы штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum с униформным характером обогащения клеточных БАС дейтерием. Использование гидролизатов дейтеро-биомассы данного штамма для биосинтеза дейтсрий-меченного инозина и бактериородопсина.

2. Методы получения дейтерий- и ¹³С -аминокислот, [1',3',4'D,8-инозина и бактериородопсина за счёт биологической конверсии дейтерометанола/13С метанола СDзОD/¹³СНзОН и тяжёлой воды D₂O.

3. Метод прямой химической модификации препаратов интактных культуральных жидкостей дансиллхлоридом/карбобензоксихлоридом и диазометаном. Применение данного метода для масс-спектрометрического анализа степеней изотопного обогащения молекул аминокислот в составе мультикомпонентных смесей при данном способе введения метки.

Апробация. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 3-м международном конгрессе по аминокислотам, пептидам и их аналогам (Вена, август, 1993), на 4-й Всероссийской научной конференции "Проблемы теоретической и экспериментальной химии"(Екатеринбург, апрель, 1994), 6-й международной конференции по ретинальным белкам (Ляйден, июнь, 1994), 7-м международном симпозиуме по генетике промышленных штаммов микроорганизмов (Монреаль, июль, 1994), 8-м международном симпозиуме по микробному росту на Ci-соединениях (Сан-Диего, август, 1995), Евроазийском симпозиуме по современным направлениям в биотехнологии (Анкара, ноябрь, 1995).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано восемь печатных работ и шесть тезисов научных конференций.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов, выводов. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 15 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и питательные среды.

Исследования проводили с генетически маркированными штаммами-продуцентами аминокислот, белков и нуклеозидов:

Штамм №l. - Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652 (leu), штамм факультативных метилотрофных бактерий, продуцент L-фенилаланина.

Штамм №2. - Methylobacillus flagellatum КТ (ile), штамм облигатных метилотрофных бактерий, продуцент L-лейцина.

Штамм №3. - Bacillus subtilis (his, tyr, ade, иrа), штамм граммотрицательиых бактерий, продуцент инозина.

Штамм №4. - Bacillus amyloliquefacien ade, иrа), штамм грамм отрицательных бактерий, продуцент тимидина.

Штамм №5. - Halobacterium halobium ET 1001, пигментсодержащий штамм галофильных бактерий, способный синтезировать бактериородопсин.

В настоящей работе использовали следующие питательные среды.

1. Минимальная среда М9 (Miller J., 1976). Среду использовали для ферментации штаммов №1 и №2 и выделения отдельных колоний.

2. Комплексная ферментационная среда (ФМ-среда) (Казаринова Л.А, 1980). Среду использовали для ферментации штаммов №3 и №4.

3. Синтетическая среда TS (Gibson Т., 1962). Среду использовали для ферментации штамма №5.

Условия адаптации и культивирования бактерий на дейтерий-содержащих средах.

Адаптацию клеток к дейтерию проводили на твёрдых агаризованных средах (2 %-ный агар), с тяжелой водой. При этом использовали как простой рассев культур до отдельных колоний на средах, приготовленных из 99,9 ат.% тяжёлой воды, так и многостадийную адаптацию бактерий на средах, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды.

Для биосинтеза меченных БАС использовали среды тех же составов, приготовленные на основе тяжёлой воды и дейтерометанола D₂О/СDзОD с использованием безводных реагентов. Полученную таким образом биомассу В. mehylicum гидролизовали в DCI и использовали в качестве источника суммарных химических компонентов для культивирования штаммов №3 и №5 соответственно.

¹³С-аминокислоты были получены за счёт конверсии ¹³СНзОН в метилотрофных бактериях.

Для введения дейтерия в молекулу бактериородопсина использовали селективную синтетическую среду TS, в которой ароматические аминокислоты -L-Phe, L-Tyr и L-Тгр были замещены их дейтерированными аналогами - L-[2,3,4,5,6-Ds]-Phe, L-[3,5-D₂]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D3]-Trp.

Методы выделения и анализа изотопно-меченых БАС.

Экстракцию липидов проводили смесью хлороформ-метанол (2:1) по методу Блайера и Дайера (Bligh E.G.. Dyer W.J, 1959).

Определение содержания глюкозы в культуральной жидкости проводили глюкозооксидазным методом (Beyrich Т., 1965).

Бактериородопсин выделяли из пурпурных мембран Н. halobium ET 1001 по методу Остерхельда и Стохениуса (Oesterhdt О., & Stohenius, 1976).

Гидролиз белка проводили с использованием 4 н. Ва(ОН): и 6 н. DC1 ( в D₂О)(110°С,24ч).

Бензилоксикарбонильные производные аминокислот получали в ходе реакции Шоттена-Баумана (GreensteinJ., Winitz M., 1961).