165972 (Сорбенты)

Сорбенты

Сорбенты, используемые для хроматографии, делят на несколько групп, каждая из которых, в свою очередь, подразделяется на типы. Классификация сорбентов может основываться на ряде признаков. Общепринятым является разделение сорбентов на группы по химической природе матрицы (основы) сорбента, а по типам – по методу химической обработки матрицы, делающей ее пригодной для использования в определенном виде хроматографии.

Основными группами сорбентов являются: 1) поверхностно-пористые сорбенты, представляющие собой непроницаемое для растворителя твердое ядро из стекла, на поверхность которого занесен тонкий слой пористого абсорбента, обычно силикагеля; 2) пористые сорбенты на основе силикагеля; 3) пористые сорбенты на основе оксида алюминия; 4) пористые сорбенты на полимерной основе.

Сорбенты первой группы были исторически первыми, стимулировавшими быстрый рост ВЭЖХ. Они представляют собой стеклянные микрошарики размером 35–50 мкм, на поверхности которых различными способами закрепляется слой силикагеля или оксида алюминия толщиной в 1–2 мкм. Этот слой кет либо использоваться для разделения методом адсорбционной хроматографии, либо модифицироваться нанесением подвижной фазы. Нанесение фазы возможно динамическим методом из растворителя, методом испарения раствора фазы, как в ГХ; наноситься могут индивидуальные вещества или же полимеры; наконец, фазами могут служить химически привитые пленки как в виде монослоев (щеточные сорбенты), так и в виде полимерных пленок разной толщины.

Создание этих сорбентов, называвшихся также пелликулярными, позволило заполнять сухим способом достаточно длинные эффективные колонки и проводить разделения разного типа достаточно быстро. Обычно эффективность составляла для колонок длиной 1–2 м 2–4 тыс. т.т. при продолжительности анализа 20–80 мин. Недостатки физически нанесенных фаз стимулировали быстрое развитие методов химической прививки фаз, далее широко использовавшихся для других групп сорбентов.

Наряду с достоинствами поверхностно-пористых сорбентов (возможность упаковки в колонки сухим способом, легкость фракционирования, широкий ассортимент привитых и нанесенных фаз) обнаружились их серьезные недостатки. Главными следует считать малую емкость по пробе, связанную с малой поверхностью сорбента в колонке (основной объем сорбента занимает непористое ядро, не участвующее в разделении), большое гидравлическое сопротивление длинных колонок, их малую производительность и быструю перегрузку в препаративной работе, сложную технологию получения сорбентов и их высокую цену, недостаточную эффективность колонок и длительность анализа.

В настоящее время поверхностно-пористые сорбенты практически не используют для аналитической работы. Единственная область применения, которая для них сейчас осталась, – это использование в предколонках. Предколонки устанавливают перед аналитической колонкой для улавливания необратимо сорбируемых загрязнений из проб, особенно в медицине и биологии. Однако несмотря на легкость перезаполнения сухим способом таких предколонок, их малая емкость по примесям по сравнению с пористыми микрочастицами и, следовательно, необходимость частого перезаполнения с большой затратой времени и сорбента позволяют усомниться в целесообразности их использования и в этой области.

Дальнейшее быстрое развитие ВЭЖХ базировалось на новом поколении сорбентов: микрочастицах диаметром от 3 до 10 мкм, главным образом на основе силикагеля, частично – оксида алюминия, а в последнее время на основе пористых полимеров.

Силикагель, его структура и химия поверхности

Силикагель представляет собой почти чистый диоксид кремния SiO2, однако технические его сорта содержат примеси. Силикагель всегда содержит большие, или меньшие количества адсорбированной воды (на этом основано его широкое использование в качестве осушителя). Кроме того, технический силикагель содержит другие оксиды, прежде всего оксид алюминия, также железа, который придает техническому силикагелю желтоватый или даже коричневый цвет. Силикагель имеет разную поверхность, составляющую обычно 100–600 м²/ г, и значительный объем пор (0,5–1,2 мл/г) с преобладанием пор диаметром от 5 до 15 нм.

Силикагель получают разными способами, позволяющими варьировать его чистоту и другие свойства. Наиболее общим является метод получения силикагеля из так называемого жидкого стекла, представляющего собой натриевую соль поликремневой кислоты, путем его обработки кислотами с последующим высушиванием образующейся поликремневой кислоты, разлом получающегося кускового силикагеля и выделением жной фракции рассеиванием. Такой метод был исторически первым, использовавшимся для получения силикагеля, применяемого в колоночной (классической) и тонкослойной хроматографии. На базе такого же силикагеля были получены первые сорбенты специально для ВЭЖХ типа партисил (фирма «Ватман») и лихросорб (фирма «Мерк»). Получали их путем сепарирования на специально разработанных воздушных сепараторах силикагеля для ТСХ.

В дальнейшем были разработаны способы получения силикагелей специально для ВЭЖХ путем направленного формования в процессе синтеза силикагеля микросфер нужной фракции с преобладанием частиц размером 3–12 мкм (фирмы Дюпон», «Мерк», «Мэчери-Нэгель», «Фейз Сепарейшн», «Сепарейшенс Груп», «Шендон Саусерн» и др.) под торговыми марками соответственно зорбакс, лихросфер, нуклеосил, сферисорб, видак, хайперсил. Регулированием процессов формования микросферического силикагеля и его отверждения, сушки последующей химической обработки получается широкая гамма сорбентов для ВЭЖХ зернением 3, 5, 7 и 10 мкм с узким фракционным составом. Если процесс формования не позволяет получить сразу узкую фракцию микросфер, их подвергают воздушному сепарированию, так же как и размолотый кусковой силикагель.

В настоящее время разные фирмы производят более 200 сорбенгов для ВЭЖХ на основе силикагеля как с неправильной формой частиц, так и в виде микросфер. Ассортимент их непрерывно расширяется за счет появления новых привитых фаз к известным силикагелям для ВЭЖХ или же новых вариантов прививки тех же фаз, появления новых силикагелевых матриц с более широкими порами или более узко сепарированных, появления новых фирм-производителей.

Вопрос о том, являются ли частицы сферической формы предпочтительными по сравнению с частицами неправильной формы и обеспечивают ли они получение каких-либо особых преимуществ, обсуждался многими авторами, однако никаких убедительных доказательств большей эффективности, стабильности, проницаемости более дорогих микросферических сорбентов представлено не было. Тем не менее следует отметить, что большая часть вновь появляющихся сорбентов имеет форму микросфер.

Химия поверхности силикагеля для ВЭЖХ независимо от способа его получения примерно одна и та же. Поверхностный слой силикагеля, который в дальнейшем работает как адсорбент или же служит той матрицей, к которой прививают химически неподвижную фазу, можно представить себе следующим образом (рис. 4.1). На поверхности силикагеля, таким образом, можно обнаружить несколько видов групп, способных к взаимодействию с веществами в процессе последующего хроматографического анализа или в процессе прививки неподвижной фазы. Прежде всего, это может быть силанольная группа со свободным гидроксилом (тип I). Во-вторых, это может быть силанольная группа, свободный гидроксил которой образует с соседним атомом кислорода за счет его неподеленной пары электронов водородную связь (тип II), при этом образуется устойчивый шестичленный цикл. В-третьих, это может быть силоксановый мостик, который образуется за счет отщепления молекулы воды от двух силанольных групп (тип III). Последний тип связи может за счет обратимой реакции гидролиза превратиться в две силанольные группы (тип I).

Количество групп как силанольных, так и силоксановых на единицу массы силикагеля зависит от ряда факторов. Так, чем больше удельная поверхность силикагеля (она меняется в пределах от 1000 до 15 м²/г), тем больше групп обоих типов находится на сорбенте в колонке и, следовательно, сильнее удерживание взаимодействующих с ними веществ. Далее, в процессе получения силикагеля он подвергается сушке, от длительности и условий которой зависит соотношение силоксановых и силанольных групп. При сушке геля поликремневой кислоты – исходного продукта для силикагеля – сначала идет поликонденсация с выделением воды и образованием жесткого скелета силикагеля. При нагревании до 200 °С вся физически сорбированная вода удаляется, а поверхность остается полностью гидроксилированной, т.е. количество силанольных групп будет максимальным, а силоксановых – минимальным. Если продолжить нагревание, силанольные группы начнут отщеплять воду с образованием силоксановых групп; этот процесс заканчивается примерно при 1000 °С. Дальнейшее нагревание приводит к спеканию частиц силикагеля с уменьшением как объема пор, так и размера частиц, а затем и к плавлению с образованием кварца.

Силанольные группы, располагающиеся на поверхности силикагеля, обладают слабокислыми свойствами и способны поэтому сильнее удерживать вещества с основными свойствами. Силоксановые группы могут в процессе работы за счет гидролиза переходить в силанольные, что меняет свойства поверхности сорбента и удерживание веществ.

Оксид алюминия

Оксид алюминия, применяемый в качестве сорбента как в газовой, так и в жидкостной хроматографии, получают путем дегидратации при высушивании гидроксида алюминия (III). Зависимости от условий дегидратации получают ряд форм – модификаций кристаллической формы оксида алюминия, из которых для хроматографии используют гамма-оксид алюминия.

Применяемый для хроматографии оксид алюминия отвечает формула, в которой на две молекулы оксида приходится молекула воды. Его поверхность и структура похожи на силикагелeвые, однако не идентичны и обеспечивают в ряде случаев селективность, отличающуюся от селективности силикагеля. Поверхностные гидроксилы оксида алюминия более прочны и полностью удаляются даже при 1000 °С. Обратная гидратация поверхности при комнатной температуре протекает медленно. Ионы алюминия в отличие от ионов кремния способны взаимодействию с многими молекулами разделяемых веществ влоть до необратимой сорбции некоторых молекул) и дают ой вклад в удерживание.

Хотя оксид алюминия широко и давно используют в колонной и тонкослойной хроматографии, его применение в ВЭЖХ имеет ограниченный характер. Это связано с тем, что микрочастицы оксида алюминия выпускают не все фирмы-производители сорбентов, а привитые фазы на этой основе не выпускаются совсем. Тем не менее в некоторых случаях, когда требуется селективность, отличная от селективности силикагеля, оксид алюминия применяют. Его также используют и в тех случаях, когда нужно перейти к ВЭЖХ от методики ТСХ, размотанной на пластинках с оксидом алюминия.

Привитые сорбенты на основе силикагеля для нормально-фазной и обращенно-фазной хроматографии

Сорбенты с химически привитыми фазами на основе силикагеля появились позже сорбентов, на которые неподвижная фаза (в виде индивидуальных веществ или, чаще, полимеров различной структуры и полярности) наносилась физически, т.е. аналогично тому, как фазу наносили и продолжают наносить в газожидкостной хроматографии. Нанесенная фаза довольно быстро смывается растворителем (гораздо быстрее, чем она испаряется или изменяется в газожидкостной хроматографии), параметры удерживания постоянно меняются, препаративно собираемые фракции загрязняются фазой. Использование растворителя, насыщенного неподвижной фазой, позволило несколько повысить стабильность таких сорбентов и колонок, однако большинство недостатков при этом осталось.

Эти проблемы можно решить, если химически привить органическую неподвижную фазу к силикагелевой матрице. Силанольные группы, находящиеся в большом количестве на поверхности силикагеля (особенно полностью гидроксилированного), обладают слабокислыми свойствами и довольно легко вступают в многочисленные реакции. Первые из полученных таким путем привитофазных сорбентов, названных «щеточные» (привитые молекулы, как щетина в щетке, покрывали поверхность силикагеля), изготовляли этерификацией силанолов спиртами с образованием простой эфирной связи. Однако обратимость реакции, особенно в кислой и щелочной средах и в присутствии водных подвижных фаз, в большой мере ограничивала как срок работы таких сорбентов, так и области их применения.

Позднее были разработаны методы получения привитых фаз разного типа с использованием гораздо более прочных и устойчивых к гидролизу связей Si-О–Si и Sj-С. Практически все имеющиеся в продаже привитофазные сорбенты относятся к этому типу, их более 200. Привить химически фазу к силикагелю может любой высококвалифицированный химик-органик по имеющимся прописям. Однако приготовить сорбент, воспроизводимый от партии к партии, чрезвычайно трудно, это не всегда удается даже обладающим как патентами, так и «ноу-хау» лабораториям и производствам фирм-изготовителей. Еще более проблематичной является попытка воспроизвести в лаборатории какой-то фирменный сорбент по имеющимся литературным и патентным данным; множество нюансов в подготовке исходного силикагеля, растворителей и реагентов, проведении реакции, удалении непрореагировавших реагентов и побочных продуктов сводят шансы на удачу почти к нулю. Точно так же проблематичным является использование при воспроизведении описанных в литературе разделений «аналогов» сорбентов других форм, что в первую очередь относится к сложным разделениям и использованию обращенно-фазных сорбентов. Сказать «использовался обращенно-фазный сорбент, представляющий собой октадецилсилан, привитый к силикагелю», – значит не сказать почти ничего, если не указана фирма-производитель. Многочисленные описанные в литературе случаи инверсии порядка выхода пиков смесей на разных сорбентах «С18 на силикагеле» и других или даже полной адсорбции ряда веществ на другом сорбенте подтверждают этот факт.

Тем не менее привито-фазные сорбенты сейчас наиболее популярны, несмотря на их высокую стоимость и отмеченные недостатки. Более 60% разделений методом ВЭЖХ (по другим данным-более 70%) выполняют с использованием только обращенно-фазных привитых сорбентов, основным из которых является сорбент с привитой фазой C18.

Можно отметить следующие преимущества, обеспечивающие преобладающее использование привитых сорбентов на основе силикагеля: механическая устойчивость к высоким давлениям; отсутствие перехода привитой фазы в растворитель в процессе хроматографического разделения (если не протекают реакции, приводящие к химическому отщеплению привитой фазы); устойчивость к действию растворителей, температуры, воды, рН; быстрота установления равновесия при смене элюента, что обеспечивает оперативность работы и возможность работы в градиентном режиме с быстрым возвратом к исходному режиму; возможность варьировать в широких пределах селективность за счет изменения степени прививки, дополнительной химической обработки и замены растворителя.

Так как среди начинающих работать в области ВЭЖХ очень большой процент составляют специалисты по ГХ, имеет смысл сделать следующее замечание. Очень большой ассортимент неподвижных фаз (неоправданно большой, по мнению многих компетентных ученых) в ГХ и стремление иметь как можно более широкий выбор фаз и в ВЭЖХ–основная ошибка начинающих. Если в газовой хроматографии, по крайней мере в ее классическом варианте, подвижная фаза практически не оказывает влияния на селективность разделения, то в жидкостной хроматографии ее влияние огромно. Так как в разделении очень активно участвуют как привитая фаза, так и адсорбированные (абсорбированные) компоненты подвижной фазы, широкий ассортимент сорбентов для ВЭЖХ в большинстве случаев не нужен. Изменением состава подвижной фазы очень часто легко добиться той же селективности, что и за счет применения нового дорогостоящего привито-фазного сорбента. Приведенное выше утверждение не относится, конечно, к принципиально новым вариантам сорбентов для ВЭЖХ (например, особо широкопористым, предназначенным для работы с большими молекулами, такими, как белки). Для начинающего же работать в ВЭЖХ рекомендуется тщательно изучить 2–4 сорбента, находящие применение для его объектов исследования, и широкий ассортимент растворителей и добавок разного типа, их влияние на разделение данного класса веществ на выбранной группе сорбентов. Только после того, как приобретен опыт работы с привитыми фазами в комплексе с растворителями, но есть задачи, которые не удается решить с их помощью, следует пробовать новые привитые фазы. Справедливость данного замечания как раз и подтверждается тем, что 60–70% успешных разделений, описанных в литературе, проведено только на привитых фазах одного типа – обращенно-фазных, к рассмотрению которых мы сейчас и перейдем.

Наиболее популярными являются так называемые обращенные привитые фазы, применяемые в обращенно-фазной ВЭЖХ. Понятие «обращенный» пришло от классической ЖХ на силикагеле, где в «прямой» системе подвижная фаза неполярна. а неподвижная полярна (соответственно гексан и силикагель). По этому принципу «обращенная» система должна иметь полярную подвижную фазу и неполярную неподвижную (соответственно водный метанол и октадецилсилан на силикагеле, привитый химически). Названия обращенно-фазный сорбент и обращенно-фазная система не являются особенно удачными или понятными, однако так как это название общепринято, то мы будем его придерживаться.