165528 (Амилолитические препараты)

АМИЛОЛИТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

Амилолитические препараты широко выпускаются в нашей стране и за рубежом. В основном это крупнотоннажное производство. Амилазы нахо­дят применение почти во всех областях, где перерабатывается крахмалсо-держащее сырье. Амилазы используют для осахаривания зернового и кар­тофельного крахмала. Самым большим потребителем амилолитических ферментов является спиртовая и пивоваренная промышленности, где в на­стоящее время солод (проращенное зерно) успешно заменяется амилолити­ческими ферментными препаратами.

Источники получения амилаз

Амилазы очень широко распространены в природе. Они синтезируются многими микроорганизмами (бактерии, грибы, актиномицеты, дрожжи), животными и растениями. До развития ферментной промышленности глав­ным промышленным источником получения амилаз в европейских странах было проросшее зерно (солод). Для медицинских целей амилазы получали из животного сырья. В настоящее время главным источником амилаз явля­ются микроорганизмы, особенно бактерии, грибы и реже дрожжи.

Механизм действия и свойства амилаз

Субстратами для действия амилаз являются крахмал, состоящий из амило­зы и амилопектина, продукты частичного гидролиза крахмала и гликоген.

Крахмал - растительный полисахарид с очень сложным строением. Это двухкомпонентное соединение, состоящее из 13-30% амилозы и 70-85% амилопектина. Оба компонента неоднородны, их молекулярная масса (М. м.) колеблется в широких пределах и зависит от природы крахмала. Амилоза - это неветвящийся полимер, в котором остатки глюкозы соеди­нены -1, 4-гликозидной связью; степень полимеризации около 2000. В «аномальных» амилозах с одной-двумя -1, 6-связями полимеризация мо­жет возрасти до 6000 (рис.1). Амило­за практически не об­ладает восстанавлива­ющей способностью, так как в каждой мо­лекуле амилозы име­ется только одна сво­бодная альдегидная группа.

Молекула амилозы представляет собой растянутую спираль, шаг которой составля­ет 10,6 А и в каждый виток входит 3 остатка глюкозы. Максималь-

Рис 1. Строение амилозы:

а — амилоза без аномальных отклонений; б - схема возмож­ных ветвлений амилозы; в — спираль амилозы в растворе с за­ключенными в ее полость молекулами йода.

Концевые звенья с

альдегидными группами 1 разветвление

- 2 разветвления 4 разветвления 8 развет

16 концевых звеньев

64 концевых

звена

Рис. 2.2. Амилопектин, схема дихо­томического деления амилопектина (по К. Мейеру):

а - в плоскости; б - в пространстве.

ная длина молекулы амилозы достигает 7000 А. В растворе спираль сжимается за счет увеличения витка, в котором уже участвует 6 остатков глю­козы. При вхождении молекул йода в спираль амилозы возни­кает характерный синий цвет. Строго говорить о величине молекулы амилозы нельзя, т. е. даже из одного образца крахмала извлекается амило­за, с величиной молекулы от 500 до 2000 остатков глюкозы. Амилопектин имеет большую молекулярную массу, чем ами­лоза, и более сложное строе­ние. Это ветвящийся полиса­харид. Предполагается, ами­лопектин ветвится дихотоми­чески, т. е. число концевых звеньев всегда на единицу больше числа звеньев, дающих ветвление, а сумма этих чисел дает общее число звеньев по всей цепи (см. рис. 2.2).

Механизм действия. К группе амилотических ферментов относятся - и -амилазы, глюкоамилаза, пуллуланаза, изоамилаза и некоторые другие ферменты. Амилазы бывают двух типов: эндо- и экзоамилазы. Четко выра­женной эндоамилазой является а-амилаза, способная к разрыву внутримо­лекулярных связей в высокополимерных цепях субстрата.

Глюкоамилаза и -амилаза являются экзоамилазами, т. е. ферментами, атакующими субстрат с нередуцирующего конца.

При изучении механизма действия амилаз имеются определенные слож­ности, и прежде всего они заключаются в том, что субстрат - крахмал неод­нороден и имеет различные характеристики по степени полимеризации гли-козидной цепи и количеству ветвлений.

Реакции, катализируемые амилазами, имеют две стадии: короткую -предстационарную и длительную - стационарную. Во время первой стадии эндоамилаза быстро уменьшает молекулярную массу субстрата, образуя смесь линейных и разветвленных олигосахаридов. Второй этап реакции продолжается, пока продукты гидролиза не перестанут окрашиваться йо­дом; он протекает значительно медленнее и зависит от индивидуальных свойств фермента и его природы. Поэтому конечные продукты гидролиза а-амилазами могут быть различными. Первая стадия воздействия фермента на субстрат хотя и носит неупорядоченный характер, имеет для всех видов -амилаз схожий механизм.

Существует две гипотезы о механизме действия экзоамилаз на субстрат. Первая гипотеза предполагает, что, воздействуя на субстрат по одноцепочечному или «молниеобразному» механизму, экзоамилаза образует фер­мент-субстратный комплекс с захватом нередуцирующего конца цепи.

Дальнейшее продвижение фер­мента по этой цепи происходит до полного ее гидролиза. По второй гипотезе (- и глюко­амилаза действуют на субстрат путем механизма множественной атаки, т. е. фермент образует комплекс с молекулой субстрата, затем через несколько этапов этот комплекс распадается и фер­мент связывается с новой моле­кулой субстрата. Иными слова­ми, при множественной атаке происходит нечто среднее между неупорядоченным механизмом и одноцепочечной, «молниеобразной» атакой. Для полного гидро­лиза по этому механизму одна

молекула субстрата должна образовывать много раз фермент-субстратные комплексы. При этом возможен гидролиз нескольких связей в одном ката­литическом акте.

Механизм воздействия амилаз на субстрат может быть рассмотрен с не­скольких позиций:

1. вид разрываемой связи (-1,4 или -1,6);

2. тип воздействия на субстрат (эндо- или экзо-);

3. влияние на скорость гидро­лиза степени полимеризации субстрата;

4) возможность гидролиза олиго­сахаридов;

1. способность фермента к множественной атаке субстрата.

Наличие признаков амилаз, отраженных в 3 и 4 позициях, при действии на линейные субстраты может свидетельствовать о существовании у этих ферментов подцентровой структуры. Вероятно, активный центр амилазы может состоять из нескольких подцентров, каждый из которых может вступать в контакты с глюкозным остатком. Энергия взаимодействия (А;), выраженная в единицах свободной энергии (кДж/моль), определяет подцентровое сродство фермента к субстрату. Это сродство индивидуаль­но и может быть как положительным, так и отрицательным. Вероятность существования подцентровых структур амилаз помогает установить стро­ение активного центра амилаз, дает более четкое объяснение субстратной специфичности, но не дает объяснений механизма гидролиза разветвлен­ных субстратов.

-Амилаза. а-Амилаза (а-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, КФ 3.2.1.1.) яв­ляется эндоамилазой, вызывающей гидролитическое расщепление -1,4-гли-козидных связей внутри высокополимеризованного субстрата. Фермент на­зван -амилазой потому, что он высвобождает глюкозу в -мутамерной форме.

а-Амилаза - водорастворимый белок, обладающий свойствами глобулина и имеющий М. м. 45 000-60 000. Своего рода исключением является -амилаза В. macerans, которая имеет М. м. 130 000. Есть указания, что некото­рые термостабильные -амилазы имеют М. м. 14 000-15 000, но в их моле­кулах содержится в 2-3 раза больше атомов кальция.

Все а-амилазы относятся к металлоэнзимам, содержание в них Са колеб­лется от 1 до 30 г атом на 1 г моль фермента. Полное удаление кальция

приводит к инактивации фермента. Повторное введение кальция в среду мо­жет частично восстановить его активность. -Амилаза В. subtilis с помощью иона цинка способна образовывать димерную форму, чего лишены другие -амилазы. Все -амилазы устойчивы к воздействию протеаз. Они богаты ти­розином и триптофаном. Глютаминовая и аспарагиновая кислоты составля­ют 25% массы белка. Наличие этих кислот в а-амилазе связывают с их оса-харивающей способностью. Так, разжижающие -амилазы не имеют сульфгидрильных групп, а осахаривающие содержат один остаток цистеина. Сравнительно мало или совсем отсутствуют в а-амилазах содержащие серу аминокислоты. Некоторые -амилазы грибного происхождения имеют уг­леводный фрагмент, в состав которого могут входить манноза, ксилоза, гексозоамин, но функции его не установлены.

В зависимости от вида микроорганизма свойства ос-амилаз могут сильно отличаться не только по механизму воздействия на субстрат и конечным продуктам, но и по оптимальным условиям для проявления максимальной активности.

Действуя на целое крахмальное зерно, -амилаза атакует его, разрыхляя поверхность и образуя каналы и бороздки, т.е. как бы раскалывает зерно на части. Клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образованием на окрашиваемые йодом продукты - в основном состоящие из низкомоле­кулярных декстринов. Процесс гидролиза крахмала многостадийный. В результате воздействия -амилазы на первых стадиях процесса в гидролизате накапливаются декстрины, затем появляются неокрашивающиеся йо­дом тетра- и тримальтоза, которые очень медленно гидролизуются -амилазой до ди- и моносахаридов.

Все -амилазы проявляют наименьшее сродство к гидролизу концевых связей в субстрате. Некоторые же а-амилазы, особенно грибного происхож­дения, на второй стадии процесса гидролизуют субстрат более глубоко с об­разованием небольшого количества мальтозы и глюкозы. Схему гидролиза под действием а-амилазы можно записать следующим образом:

а-Амилаза

Крахмал,----------------> а-Декстрины + Мальтоза + Глюкоза

гликоген (много) (мало) (мало)

-Амилаза. -Амилаза (-1,4-глюкан мальтогидролаза, КФ 3.2.1.2) - активный белок, обладающий свойст­вами альбумина. Каталити­ческий центр фермента со­держит сульфгидрильные и карбоксильные группы и имидозольный цикл остат­ков гистидина. -Амилаза -экзофермент концевого дей­ствия, проявляющий срод­ство к предпоследней -1,4-связи с нередуцирующего конца линейного участка амилозы и амилопектина.

В отличие от -амилазы -амилаза практически не гидролизует нативный крахмал, тогда как клейстеризованный крахмал гидро­лизуется ею с образованием мальтозы -конфигурации, поэтому данная амилаза по аналогии с -амилазой на­зывается -амилазой. Если гидролизу подвергается амилоза, то гидролиз идет полностью до мальтозы. Не­значительное количество декстринов может образовы­ваться при гидролизе «ано­мальных» амилоз, так как гидролиз -амилазой идет только по линейной цепи до -1,6-связей. Если субстратом для -амилазы служит амилопектин, то гидролиз идет в значительно меньшей степени. -Амилаза отщепляет фрагмент с не­редуцирующего конца участка от внешних линейных ветвей, имеющих по 20-26 глюкозных остатков, с образованием 10—12 молекул мальтозы. Гид­ролиз приостанавливается на предпоследней -1,4-связи, граничащей с -1,6-связью. В гидролизате накапливается 54-58% мальтозы, остальное составляют высокомолекулярные декстрины, содержащие значи­тельное количество а-1,6-связей - так называемые -декстрины. Действие -амилазы на крахмал можно записать в виде следующей схемы:

-Амилаза

Крахмал,----------------> Мальтоза + р-Декстрин

гликоген (54-58%) (42-46%)

-Амилазы проявляют большую стабильность в отсутствие ионов Са²⁺. Молекулярная масса -амилазы растений достаточно высока, она составля­ет от 50 000 до 200 000. Фермент может состоять из одной или четырех

субъединиц до 50 000 каж­дая. Фермент содержит SH-группы и чувствителен к действию тяжелых метал­лов. Считается, что (-ами-лаза обладает высокой спо­собностью к множествен­ной атаке субстрата. Для амилозы средней молеку­лярной массы в одном при­соединении фермента к суб­страту возможно отщепле­ние до четырех остатков мальтозы. При увеличении молекулярной массы суб­страта возможно и большее количество мест атаки.

Глюкоамилаза. Глюкоамилаза (а-1,4-глюкан глюкогидролаза, КФ 3.2.1.3.) широко распространена в природе. Она синтезируется многими ми­кроорганизмами и образуется в животных тканях, особенно в печени, почках, плаценте кишечника и т. д. Фермент в литературе известен под различ­ными названиями: амилоглюкозидаза, -амилаза, лизосомальная -глюкозидаза, кислая мальтаза, матулаза и экзо-1,4--глюкозидаза. Глюкоамилаза катализирует последовательное отщепление концевых остатков -D-глюкозы с нередуцирующих концов субстрата. Это фермент с экзогенным механизмом воздействия на субстрат. Многие глюкоамилазы обладают способностью так же быстро, как и -1,4-связь, гидролизовать -1,6-глюкозидные связи. Но это происходит только в том случае, когда за -1,6-связью следует -1,4-связь, поэтому декстран ими не гидролизуется. От­личительной особенностью глюкоамилаз является способность в десятки раз быстрее гидролизовать высокополимеризованный субстрат, чем олиго-и дисахариды.

В литературе высказывается мнение, что ме­ханизм атаки субстрата глюкоамилазой может быть двух типов: либо одно-цепочечный, либо множественной атаки, и что активный центр имеет под-центровую структуру.

Почти все глюкоамилазы являются гликопротеидами, содержащими от 5 до 35% углеводов, которые состоят из олиго-, ди- и моносахаридов. Угле­водный компонент может быть целостным фрагментом или же разбитым на индивидуальные соединения, которые прикрепляются к белку через трео­нин и серин. Например, у глюкоамилазы A. niger их 20. Большинство из­вестных глюкоамилаз имеет оптимум рН при 4,5-5,2, реже - при 5,7-6,0, в основном для дрожжевых глюкоамилаз.

РН-стабильность микробных глюкоамилаз лежит в широком диапазоне -от 2,5 до 9. Термостабильность глюкоамилаз лежит в интервале от 30 до 45°С и редко повышается до 55-60°С. Глюкоамилазы различного происхо­ждения заметно отличаются по молекулярной массе, которая, по данным различных авторов, имеет значения от 48 000 до 210 000. Следует заме­тить, что далеко не все микробные глюкоамилазы способы полностью гид­ролизовать крахмал до глюкозы. Еще в 60-х годах И.Фукумото предложил все микробные глюкоамилазы разделить на два типа:

1. полностью гидро­лизующие крахмал до глюкозы и

2. гидролизующие крахмал до глюкозы на 80-85%.

В то время предполагалось, что степень гидролиза зависит только от свойств глюкоамилаз и их происхождения. Позже было показа­но, что при росте культуры параллельно накапливаются и другие амилоли­тические ферменты, обладающие не только гидролитическим, но и трансферазным действием. Это гликозилтрансфераза и -амилаза. Даже в слу­чае, если система открытая и продукт гидролиза (глюкоза) постоянно уда­ляется из системы, процесс может дойти до полного гидроли­за крахмала до глюкозы. Если же система закрытая и концентрация суб­страта велика, то при достижении определенной концентрации глюкозы в реакционной среде в результате переноса глюкозильных остатков на глю­козу, ди- и олигосахариды начинают накапливаться изомальтоза, паноза, нигероза, изомальтотриоза и другие сахара, которые имеют горький вкус. В результате процесс не может дойти до полного превращения крахмала в глюкозу и возникает ошибочное представление, что глюкоамилаза не пол­ностью гидролизует крахмал. Сама же глюкоамилаза может проявлять не­большую трансферазную активность, но только при концентрации глюко­зы свыше 60-70%. Поэтому ранее принятое деление глюкоамилаз на два типа следует считать необоснованным.

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СХЕМЫ И РЕЖИМ ПОЛУЧЕНИЯ СПИРТА

Технология этилового спирта из крахмалистого сырья основана на ферментативном гидролизе зернового или картофельного крахма­ла и сбраживании образующихся сахаров дрожжевыми микроорга­низмами, т.е. является биохимической технологией.