123342 (Микроскопическое исследование древесины и целлюлозных волокон)

РЕФЕРАТ

Микроскопическое исследование древесины и целлюлозных волокон

Казань, 2009

Введение

Производство волокнистых полуфабрикатов в ЦБП и разработка новых технологий комплексной химической переработки всей биомассы дерева невозможны без глубокого изучения микроскопического и субмикроскопического строения древесины и целлюлозных волокон. Под древесиной понимают главную часть ствола дерева, освобожденную от коры. С биологической точки зрения древесина — продукт деятельности камбия, состоящего из определенных клеточных элементов. Клетки одинакового строения, выполняющие одну и ту же функцию, образуют ткани. Различают три основных типа тканей: проводящие, механические и запасающие. Большинство клеток древесины направлено вдоль оси ствола и только клетки сердцевинных лучей расположены в радиальном направлении.

Сложное анатомическое строение древесины существенно различается Как у разных древесных пород, так и в пределах одного дерева. Строение ствола дерева и древесины довольно подробно описано в ряде монографий и руководств. В данном учебном пособии приведены описания препаратов древесины некоторых хвойных и лиственных пород, используемых в отечественной целлюлозно-бумажной промышленности, а также основные гистохимические реакции целлюлозных волокон, полученных из древесины различными методами варки и отбелки.

1. Основные методы анатомического анализа древесных тканей и целлюлозных волокон

Основными методами анатомического анализа древесины и целлюлозных волокон являются: микроскопический, гистохимический и метод мацерации тканей. Все исследования проводятся с помощью микроскопа при увеличении 70 X или 120ч и в отдельных случаях, особенно при определении вида волокон по морфологическим признакам, при увеличении 200Х или 500ч.

Микроскопический метод заключается в изготовлении очень тонких, прозрачных срезов и их исследовании в проходящем свете с помощью оптического микроскопа. Этот метод позволяет изучить строение древесины и определить породный состав по диагностическим признакам.

Гистохимический метод основан на способности древесного волокна давать определенную окраску при взаимодействии специфических химических реагентов с каким-либо компонентом клеточной стенки. Подбирая соответствующие реагенты, можно различать по окраске волокнистые полуфабрикаты, изготовленные различными методами варки и отбелки, например сульфатную целлюлозу от сульфитной, беленую от небеленой.

Для выявления различий в породном составе древесины возможности гистохимического метода ограничены. С его помощью можно только отличать древесину хвойных пород от древесины лиственных, для чего чаще всего используют реакцию Мейле, которую проводят не на волокне, а на древесной щепе.

Метод мацерации тканей заключается в разделении древесной ткани на составляющие ее анатомические элементы и последующем определении их размеров: длины, толщины и толщины клеточной стенки.

В научно-исследовательских лабораториях для изучения субмикроскопической структуры стенки древесного волокна, ее изменений при различных технологических процессах получения и переработки целлюлозы широко используют различные физические методы: микроскопию в поляризованном свете, которую применяют, например, для исследования волокон с высокой степенью молекулярной ориентации, обладающих двойным лучепреломлением; микроскопию в ультрафиолетовом свете, позволяющую изучать распределение лигнина в клеточной стенке; электронную микроскопию. Последний метод наиболее эффективен в сочетании с другими методами исследования структуры, особенно с рентгенографией и электронографией.

По способу исследования объектов электронные микроскопы можно разделить на следующие типы:

просвечивающие, в которых исследуемый объект просвечивается пучком электронов, создающим затем на экране или фотопластинке соответствующее изображение;

растровые, в которых изображение создается электронами, отраженными исследуемой поверхностью, причем пучок электронов сканирует поверхность подобно лучу в телевизионном кинескопе;

отражательные, в которых аналогично отражательному металломикроскопу изображение получается за счет потока электронов, отраженных от поверхности рассматриваемого объекта;

эмиссионные, в которых изображение формируется электронами, испускаемыми поверхностью самого исследуемого объекта.

Для исследования древесины и целлюлозных волокон при помощи электронного микроскопа применяют прямые и косвенные методы. К прямым методам относятся метод подготовки объектов необходимой толщины диспергированием и метод ультратонких поперечных и продольных срезов, к косвенным — получение реплик с поверхности образцов древесины, целлюлозных волокон или их срезов.

В настоящее время наряду с усовершенствованием просвечивающих электронных микроскопов находит все более широкое применение растровая электронная микроскопия. Растровый микроскоп отличается большой универсальностью и благодаря высокой глубине фокуса дает возможность с достаточной резкостью наблюдать поверхности образцов в трех измерениях. Для исследования в растровом микроскопе объекты готовят с помощью замораживания, травления или непосредственно изучают объект без специальной подготовки.

2. Микроскопическое исследование срезов древесины

Для микроскопического изучения строения древесины пользуются тремя срезами в трех взаимно перпендикулярных плоскостях: поперечным и двумя продольными — радиальным и тангенциальным, параллельным касательной окружности дерева.

Древесина как хвойных, так и лиственных пород на поперечном сечении состоит из концентрических годичных слоев. Эти слои можно различать благодаря образованию ранней и поздней древесины. Ранняя древесина менее плотная и более темная. Годичные слои хорошо различимы в древесине хвойных и кольцесосудистых лиственных пород и мало заметны у рассеянно-сосудистых. Ширина годичного слоя составляет от 1 до 10 мм и зависит от породы деревьев и условий роста: чем лучше условия роста, тем шире годичный слой. На радиальном срезе также можно заметить годичные слои, а на тангенциальном они отсутствуют, так как разрез может пройти только в какой-то одной части годичного слоя — в ранней или поздней древесине.

Микроскопическое исследование срезов древесины позволяет изучать ее анатомические элементы. Отдельные анатомические элементы и их диагностические признаки изучают также используя метод мацерации древесной ткани.

3. Подготовка препаратов и работа с микроскопом

Для приготовления препаратов к исследованию в микроскопе необходимы предметные и покровные стекла, препаровальные иглы, копьецо, стеклянные капельницы, чашки Петри, кристаллизаторы, ситечки и фильтровальная бумага. Предметные стекла—стеклянные пластинки прямоугольной формы размером 75ч25 мм, толщиной 1,2 мм. Покровные стекла — тонкие стеклянные пластиночки размером 18X 18, 20ч20 мм. Предметные и покровные стекла должны быть чистыми, перед употреблением их протирают кусочком мягкой ткани, хранят в специальных коробочках.

Подготовка срезов. Изготовление срезов древесины проводят вручную остро отточенной бритвой или на специальных приборах — микротомах и ультрамикротомах. Первый метод, хотя и имеет большую давность, не потерял своего значения до настоящего времени. Основные его преимущества перед работой на микротомах — это быстрота и простота в приготовлении среза.

Получение срезов древесины на микро- или ультрамикротоме требует сложных методов фиксации и резки материала.. Подготовка срезов состоит в последовательном проведении следующих операций: обезвоживания; пропитки; полимеризации; заточки блока; изготовления ножа; резки; освобождения от полимеризата; окраски; промывки; фиксации. Этот метод используют главным образом для приготовления ультратонких срезов для электронной микроскопии. Для изготовления срезов древесины вручную применяют опасную бритву, имеющую одну совершенно плоскую сторону, без выемки или лезвия безопасной бритвы. Исследуемый образец древесины цилиндрической или прямоугольной формы вырезают из кусочка ствола острым ножом или скальпелем. Перед резкой образец древесины кипятят в течение 30 мин, а иногда и нескольких часов в воде с последующим переносом его в холодную воду или остыванием в том же сосуде, в котором проводилось кипячение. Это необходимо для удаления из древесины пузырьков воздуха и получения образца с определенной твердостью. Свежесрубленная древесина в большинстве случаев режется без всякой подготовки, но при этом ее необходимо держать в воде. Фиксированные образцы тщательно промывают водой в течение некоторого времени, чтобы удалить фиксирующий материал.

Образец мокрой древесины помещают между двумя кусочками пробки или бузины и для образования ровной поверхности срезают древесину острым ножом. Затем поверхность древесины смачивают водой и осторожно с нее снимают бритвой слои вместе с пробкой. Бритву также все время смачивают водой или спиртом, держат наискось, плоской стороной вниз, острием от себя и протягивают через объект скользящим движением, свободно и легко. Нельзя при этом прижимать локти к туловищу или опираться ими на стол, так как это лишит руки свободы движения. Если бритва врезалась в древесину слишком глубоко, лучше вынуть ее во избежание поломки. Срезы должны получаться очень маленькими и совсем прозрачными. Полученные срезы снимают с лезвия очень осторожно мягкой кисточкой, переложив бритву в левую руку и не выпуская объект. Для проверки качества срезы переносят в заранее приготовленную каплю воды на предметном стекле и просматривают при малом увеличении микроскопа. Если срезы плохие, то их выбрасывают и делают новые.

Следует отметить, что приготовление срезов вручную требует известного навыка и умения владения опасной бритвой, чтобы получить с ее помощью удовлетворительные срезы. Необходимо бережно обращаться с бритвой, постоянно точить и править ее, оберегать от ударов и реактивов, держать сухой и закрытой.

Подготовка препаратов. Из полученных срезов готовят временные или постоянные препараты. Изучать древесину и целлюлозные материалы с помощью микроскопа через воздушную прослойку нецелесообразно, так как вследствие отражения лучей света от боковых частей материала его контуры будут видны очерченными слишком темными линиями. Поэтому исследуемый материал заключают в какую-либо жидкость, которая уменьшает отражение лучей и увеличивает прозрачность.

Для более контрастного выявления особенностей строения анатомических элементов на срезах древесины до заключения их в ту или иную среду проводят окрашивание. Наиболее часто для окраски применяют 1%-ный водный раствор сафранина или комбинацию красителей: сафранин и водный синий; хризоидин и водный синий либо светлый зеленый. Срезы помещают в ванночку с красителем и выдерживают в нем в течение 5 мин, затем избыток красителя отмывают водой, глицерином или спиртом.

Приготовление временных препаратов. Каплю воды наносят пипеткой или стеклянной палочкой на середину чистого сухого предметного стекла, препаровальными иглами переносят в нее срез и накрывают покровным стеклом. Покровное стекло прикладывают к предметному под острым углом так, чтобы оно касалось края капли; после этого его осторожно опускают. Капли жидкости, выступающие по краям покровного стекла, удаляют слегка смоченной фильтровальной бумагой, подводя ее к одному краю покровного стекла. Если жидкости под стеклом мало, ее добавляют, приподняв покровное стекло, или наносят каплю воды вплотную к краю покровного стекла. При резком опускании покровного стекла в жидкости остаются пузырьки воздуха, заметные под микроскопом, в виде черных резко очерченных кружков, которые мешают изучению объекта в микроскопе.

Временные препараты могут быть использованы для исследований только на одном занятии. Долго сохранять их невозможно, так как вода быстро испаряется.

Приготовление постоянных препаратов. Для сохранения препарата в течение длительного времени окрашенные срезы древесины заключают не в воду, а в глицерин-желатиновую смесь или в пихтовый бальзам. Перед заделкой срезы обезвоживают.

В случае приготовления глицерин-желатиновых препаратов воду и избыток красителя из срезов удаляют тщательной промывкой глицерином с его отсасыванием. Эту операцию можно проводить на воронке фильтрующей обратной типа ВФОТ диаметром 10...20 мм. После этого срезы заключают в глицерин-желатину.

Глицерин-желатину стеклянной палочкой наносят на срез, предварительно помещенный на предметное стекло. Чтобы глицерин-желатина сразу не застыла на холодном предметном стекле, его слегка подогревают на спиртовке. На теплую каплю накладывают покровное стекло, также прогретое на пламени спиртовки, и кончиком иглы осторожно придавливают стекло, равномерно распределяя глицерин-желатину. Когда среда остынет, края покровного стекла можно обвести лаком, чтобы предотвратить высыхание желатины. Этот способ приготовления препаратов достаточно простой, но срезы со временем обесцвечиваются.

Для заключения среза в бальзам процесс обезвоживания осуществляется значительно сложнее, так как ксилол, в котором растворен бальзам, совершенно не смешивается с водой. Вода, оставшаяся в срезе, образует муть. Обезвоживание проводят водным этанолом восходящей концентрации: 40%-ным в течение I мин; 70 и 96%-ми — по 2 мин. Для удаления последних следов воды срез обрабатывают двумя каплями фенол-ксилола в течение 2...3 мин и после просветления для удаления фенола срез промывают в чистом ксилоле.

Для заключения препарата в бальзам одну-две капли его раствора в ксилоле наносят стеклянной палочкой на срез и накладывают покровное стекло. Слегка надавливая на покровное стекло препаровальной иглой, удаляют из под него избыток бальзама и пузырьки воздуха. Выступивший вокруг покровного стекла бальзам удаляют нагретым копьецом или перочинным ножом. Через несколько дней бальзам у краев стекла подсохнет и препарат может быть окончательно вычищен бензином.

Все операции по заключению в бальзам и глицерин-желатину могут быть проведены непосредственно на предметном стекле. Обычно на одно предметное стекло помещают рядом три среза: поперечный срез располагают слева, а продольные — справа один под другим. За ходом обработки следят при малом увеличении микроскопа или в штативной лупе, не покрывая срезы покровным стеклом. Готовые постоянные препараты хранят в коробочках в вертикальном положении.