11203 (Активность плаценты при гестозах), страница 3

При легких формах поздних гестозов отмечена активация ККС, однако, при прогрессировании данной патологии наступает истощение регулирующих систем [19]. Выявлена положительная корреляция между S/D соотношением и активностью КПN [19].

В плацентарном трофобласте обнаружена также нейтральная эндопептидаза 24.11 (НЭП). Экспрессируется цитотрофобластом, синцитиотрофобластом и клетками стромы хориона. Предполагается, что НЭП 24.11 имеет отношение к обмену веществ между матерью и плодом. Фермент участвует в деградации брадикинина, окситоцина, вещества Р, нейротензина. Указывается также на возможное вовлечение нейтральной эндопептидазы в деградацию ХГЧ. При иммуногистохимических методах исследования было показано увеличение выражения плацентарной НЭП 24.11 при преэклампсии, что позволяет предположить вовлечение фермента в патофизиологические изменения при данном гестационном осложнении. Вероятно, это связано с участием фермента в регуляции местных концентраций биологически активных пептидов в фетоплацентарном комплексе [9].

Таким образом, при гестационных осложнениях отмечаются изменения в функционировании ферментных систем плаценты, в том числе тех, которые участвуют в образовании и инактивации регуляторных пептидов [11, 12, 13,16]. Последние, в свою очередь, могут быть вовлечены в нарушение многочисленных адаптационных реакций. Поэтому очень важным представляется исследование активности ферментов обмена нейропептидов при патологиях беременности.

1.4. Пептидгидролазы плаценты

1.4.1 Основные карбоксипептидазы

Основные карбоксипептидазы - пептидгидролазы, отщепляющие остатки основных аминокислот (аргинина и лизина) с С-конца пептидов. Им принадлежит важная роль в регуляции уровня биологически активных пептидов в организме [11,12] при различных физиологических и патологических процессах [11,12].

1.4.1.1. Карбоксипептидаза H

Карбоксипептидаза Н (карбоксипептидаза Е, энкефалинконвертаза, КФ 3.4.17.10) – впервые выделена и очищена в 1982 году Фрикером и Снайдером из хромаффинных гранул надпочечников быка, как фермент, образующий энкефалины из их предшественников [63]. КПH – одноцепочечный гликопротеин, экзопептидаза секреторных везикул. Фермент представлен во всех органах и тканях как в растворимой, так и в мембраносвязанной формах. Синтезируется в виде неактивного зимогена с Mr 75000, который превращается в активную форму под действием трипсиноподобных ферментов в ходе созревания секреторных везикул.

КПН – тиол-зависимый цинк-металлофермент. pH оптимум соответствует pH внутри секреторных гранул – 5,5–6,0. Активаторами фермента являются ионы Со²⁺, Ni²⁺, ингибиторами – Сd²⁺ , Cu²⁺, хелатирующие агенты: ЭДТА, о-фенантролин; реагенты на сульфгидрильные группы: ПХМФС, ПХМБ, N-этилмалеимид; органические кислоты, содержащие амино- или гуанидиновую группу: ГЭМЯК, ГПЯК, АПМЯК, АПЯГ, МГТК. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и ГПЯК с К_i 8,8 и 7,5 нМ соответственно.

Высокая активность фермента выявлены в мозге, гипофизе, хромафинных гранулах надпочечников, эндокринных клетках поджелудочной железы, плаценте [20]. Плацентарная КПН локализована в наружных ворсинках трофобласта, утероплацентарных васкулярных эндотелиальных клетках, ворсинках хориона, амниотических эндотелиальных клетках, гладких мышечных клетках пупочных сосудов (вены и артерий) [20]. Ассоциирована со структурными элементами ЭПР (в гладких мышечных клетках сосудов пуповины), комплекса Гольджи и секреторными везикулами, где протекает процессинг предшественников различных биологически активных пептидов. Фермент обнаружен в секреторных везикулах, содержащих энкефалины, атриальный натрийуретический фактор [78,80], глюкагон [77, 81], инсулин, АКТГ, пролактин [65], вещество P, вазопрессин и окситоцин и другие регуляторные пептиды.

Плацента, являясь эндокринным органом, продуцирует белковые гормоны, которые, участвуют в формировании и поддержании гомеостаза матери и плода. Кроме того, пептиды вовлекаются в патогенез гестационных осложнений. Поэтому изучение активности карбоксипептидазы Н в плацентарной ткани ОПГ-гестозах представляет актуальность.

1.4.1.2. ФМФС-ингибируемая карбоксипептидаза

В 1995 г. Генгин, Вернигора и соавт. обнаружили в растворимой фракции серого вещества головного мозга котов основную КП [], активность которой полностью подавляется ФМСФ [42]. Позднее фермент был обнаружен во всех отделах мозга и практически во всех тканях и органах крыс.

По результатам гель-фильтрации, данный фермент имеет Мr 100000 – 110000. pH оптимум – 6,0–6,5. Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы полностью подавляется ингибитором сериновых протеиназ – ФМСФ и реагентом на сульфгидрильные группы – ПХМБ, примерно на 40% фермент ингибировался иодацетамидом. Фермент почти в 2 раза активировался 50 мМ NaCl, несколько слабее – NaBr, KCl и KJ.

По данным тонкослойной хроматографии было обнаружено, что частично очищенный фермент отщеплял аргинин от лей⁵-энкефалин-арг⁶ и дансил-фен-лей-арг с образованием лей⁵-энкефалин и дансил-фен-лей соответственно. Более глубокого гидролиза субстратов не наблюдалось. Фермент также не расщеплял субстрат КПA – карбобензокси-гли-лей [42, 47]. Таким образом, по субстратной специфичности ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза сходна с ЛКПB. Вместе с тем физико-химические свойства фермента (ингибирование ФМСФ, нечувствительность к ЭДТА, ГЭМЯК и ионам Co²⁺) отличают его от ЛКПB. Ингибирование фермента ФМСФ позволяет предположить, что он является сериновой карбоксипептидазой. В тканях млекопитающих обнаружены две сериновые карбоксипептидазы – ЛКПА (КФ 3.4.16.1, катепсин A, лизосомальная карбоксипептидаза L) и карбоксипептидаза C (КФ 3.4.12.4, ангиотензиназа C, пролилкарбоксипептидаза). Но ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза отличатся от карбоксипептидазы C по молекулярной массе и субстратной специфичности.

В то же время, ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза имеет сходные с ЛКПA молекулярную массу, оптимум pH, ингибиторный профиль, но отличается от последней по субстратной специфичности и тканевой локализации.

Обращает на себя внимание тот факт, что сродство обнаруженного фермента к дансил-фен-лей-арг (К_m гидролиза – 48 мкМ), выше, чем сродство КПН (К_m гидролиза – 96 мкМ). Это позволяет предположить, что энкефалин-лей⁵-арг⁶ может быть лучшим субстратом для ФМСФ-ингибируемой КП, чем для КПН. ФМСФ-КП проявляет существенную активность при значениях рН, соответствующих таковому внутри секреторных везикул. Таким образом, возможно, что обнаруженный фермент вовлекается в процессинг нейропептидов. В связи с этим представляет интерес изучение активности ФМСФ-ингибируемой КП в плацентарной ткани в норме и при патологии.

1.5 Перекисное окисление липидов и антиоксидантная система фетоплацентарного комплекса при физиологической беременности и ОПГ-гестозах

При физиологической беременности скорость инициированного окисления липидов повышается примерно в 3 раза, нет существенной разницы между этими показателями в сроки 3-6 и 8-12 нед беременности. Во время беременности в связи с возрастанием основного обмена и увеличением потребления кислорода в крови происходит ряд значительных биохимических изменений: повышается концентрация нейтрального жира, холестерина и липидов. Наряду с этим увеличивается активность фосфолипазы А₂. В результате ее действия в крови увеличивается концентрация ненасыщенных жирных кислот, которые являются непосредственным субстратом для перекисного окисления. Концентрация гидроперекисей липидов при физиологической беременности возрастает примерно в 4,2 раза (в 3-6 нед) и в 4,5 раза (в 8-12 нед).

Нарушение микроциркуляции при ОПГ-гестозах вызывает существенные изменения метаболизма. В клетках происходит активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) и фосфолипаз с образованием токсичных радикалов: в крови повышаются продукты пероксидации (гидроперекиси в 3-4 раза, МДА – в 1,5-2 раза соответственно степени тяжести) и концентрация фосфолипазы А2 в 1,2-1,5 раза. Образование токсичных радикалов, а также дефицит ПНЖК нарушают барьерную и матричную функции клеточных мембран. Об этом свидетельствует повышение параметра упорядоченности липидного бислоя мембраны (микровязкости мембран) с 0,685+0,011 отн. ед. при легкой степени заболевания до 0,714+0,002 отн. ед. при эклампсии (при норме 0,673+0,001 отн. ед.). Одновременно с этим отмечено выраженное уменьшение гидрофобности мембран в 1,3-2,1 раз, соответственно тяжести заболевания, а, следовательно, увеличение гидрофилии липидного бислоя, и как следствие – его повышенную проницаемость. Нарушение барьерной функции липидного бислоя мембран сопряжено с изменением функционирования каналов для ионов, в первую очередь Са⁺⁺, а также – Na⁺, Ka⁺, Mg⁺⁺. Массивный вход Са⁺⁺ в клетку приводит к необратимым изменениям в ней, в частности к энергетическому голоду и ее гибели, с одной стороны, а с другой – дополнительно к мышечной контрактуре и вазоспазму.

Повреждающее действие свободных радикалов и перекисных соединений на клетки органов и тканей резко ограничивается или вовсе предупреждается сложной многокомпонентной антиоксидантной системой, в которой различают ферментативные (оксидоредуктазные ферменты и антиперекисные ферменты) и неферментативные (низкомолекулярные тиолы, аскорбиновая кислота, токоферол, витамины А, К, Р, убихинон и др.) звенья. По-видимому, защита структурных биологических мембран осуществляется преимущественно липидными биоантиоксидантами. В настоящее время все большее число исследователей полагают, что гестозы возникают вследствие нарушения антиокислительного равновесия [Воскресенский О. Н. Биофизические и физико-химические исследования в витаминологии // М. 1981. 69с.; Грищенко В. И. Современные методы диагностики и лечения позднего токсикоза беременных.// М., Медицина. 1977.186с.; Грищенко В. И., Лупояд В. С., Лікування внутрішньоутробної гіпоксії плода // Клінічна фармація.— 2003.— Т.7.— № 3. С. 37–39. ], которое в норме поддерживается витамином Е (внутриклеточный и циркулирующий в крови), глутатион-пероксидазой, постоянной или индуцированной супероксиддисмутазой и каталазой, а также внутриклеточным и внеклеточным церулоплазмином.

Активность антиоксидантного фермента глутатионпероксидазы в эритроцитах существенно не изменена как при физиологической беременности, так и при риске невынашивания в обоих критических сроках. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в ранних сроках беременности повышается значительно. Одновременно уровень -токоферола и ретинола снижается в плазме и повышается в плацентарной ткани. Была выявлена связь между гипертензией беременных и снижением концентрации витамина Е в плазме крови [Cerelati L., Massei M. // Acta vitamin.(Milano). 1950. Vol.197.— P.202–211. ].

Важными ферментами АОС являются каталаза и церулоплазмин. Церулоплазмин — медьсодержащая оксидаза, относится к альфа-2-глобулиновой фракции плазмы крови человека. Основные из известных биологических свойств этого белка — участие в транспорте меди, реакциях острой фазы воспаления и стресса, нейроэндокринная регуляция, поддержка кроветворения. Особый интерес вызывают также антиоксидантные, иммунорегулирующие, радиопротективные свойства. Благодаря своей высокой ферроксидазной активности ЦП предотвращает неферментативные реакции, дающие начало свободным радикалам и дальнейшему развитию ПОЛ. При физиологических условиях ЦП крови ингибирует ПОЛ на 50%. Подавление ПОЛ достигается за счет перехвата и инактивации супероксидного ион-радикала О2, иными словами, он выступает как внеклеточная супероксиддисмутаза. Церулоплазмин может выступать как регулятор функции NО-синтетазы в эндотелиальных клетках сосудов, контролируя сосудистый тонус [11Bianchini A., Musci G. and Galabrese L. Inhibition of endothelial nitric-oxide synthase by ceruloplasmin. J Biol Chem 1999;274:20265—20270.].

Выявлено увеличение концентрации ЦП у беременных в сравнении с их значениями у небеременных, что является характерным для физиологически протекающего гестационного процесса [17 Бурмистров С.О., Опарина Т.И., Прокопенко В.М., Арутюнян А.В. Показатели процесса деградации белков и антиокислительной системы при нормальной беременности. Акушерство и гинекология 2001; 6: 12—16). . По-видимому, данный факт объясняется активацией системы ПОЛ при беременности, приводящей в свою очередь к активации антиоксидантной системы защиты организма. Кроме того выявлено достоверное снижение активности ЦП при гестозах и ФПН, что вероятно, может быть объяснено истощением антиоксидантной системы защиты организма в условиях ее напряженного функционирования, вызванного развитием указанных тяжелых осложнений беременности. [15,16Guhrer Orhan H., Ozgunes H., Beksac M.S. Correlation between plasma malondialdehyde and ceruloplasmin activity values in preeclamptic pregnancies. Clin Biochim 2000; 34:505—506. ; Vitoraros N., Salamalekis E., Dalamaga N., Kassanos D., Greatsas G. Defective antioxidants mechanisms via changes in serum ceruloplasmin and total iron binding capacity of serum in women with pre-eclampsia. Eur J Obstet Gynecol 1999;84:63—67.; .( Авторы: Т.А. Крайнева¹, Ю.В. Морозова², Л.М. Ефремова¹, Л.А. Шерер¹, Т.С. Качалина² ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТОЧНОГО ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН – Выпуск Том 51, Выпуск 6 –нижегородский медицинский журнал)]. Предполагается что при гестозах активность ЦП является отражением общего состояния антиоксидантной ситемы защиты организма, поэтому этот параметр может быть использован в качестве одного из диагностических критериев для оценки степени тяжести гестоза.