NaNO₃ – 2;

MgSO₄ – 0,5;

FeSO₄ – 0,01;

KH₂PO₄ – 1;

KCl – 0,5;

дистиллированная вода – 1000 мл.

Для многих грибов среды являются неполноценными. Некоторые грибы (особенно витаминозависимые) растут на них плохо или совсем не растут. В таких случаях, если потребность данного организма в витаминах не изучена, необходимо добавлять в среду экстракты растительных или животных тканей, выбирая их исходя из экологии данного гриба. Например, в среды для выращивания грибов – дереворазрушителей добавляют опилки из древесины той породы дерева, которую они поражают в природе, для выращивания грибов – паразитов растений – ткани растения – хозяина; выращивание грибов – копрофилов производится на средах с навозным экстрактом (Беккер, 1983).

2.3 Приготовление питательных сред

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла. Перед употреблением посуду тщательно мыли, полоскали и высушивали. Среды варили в стеклянных колбах объемом 250 мл. Каждой среды готовили объемом по 100 мл, рассчитанной на 5 культур исследуемых штаммов. После варки среды стерилизовали в автоклаве при 0,5 атм. и 120 ^○С в течение 20 минут. После стерилизации и добавления соответствующих источников углеродного питания среды разливали в стерильные чашки Петри по 20 мл. Предварительно в чашки вносят по 1 капле молочной кислоты для подкисления среды, которое необходимо, чтобы убить бактерии.

2.4 Определение способности плесневых грибов использовать соединения углерода

Микромицеты характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического метаболизма. Чтобы выяснить возможность роста гриба за счет тех или иных углеродсодержащих веществ, их высевают на синтетические среды, содержащие в качестве единственного источника углерода различные моно-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды.

В данной работе определение особенностей роста грибов на различных источниках углеродного питания проводилось путем поверхностного посева исследуемых штаммов на среду Чапека с различными источниками углерода и среду Частухина (для целлюлозоразрушающих грибов). Посев культур осуществляли уколом в центр чашки Петри. Время культивирования составляло 14 суток, температура культивирования – 25±2 ^○С. Значение применяемых питательных сред для процессов роста грибов оценивалось методом измерения радиальной скорости роста путем периодического замера диаметра колоний грибов (через каждые 48 часов), растущих на чашках Петри.

Для определения способности микромицетов использовать различные источники углерода применяют и другие методики.

Например, многие микромицеты могут использовать в качестве единственного источника углерода органические кислоты. Для определения способности расти на средах с органическими кислотами рекомендуется плотная среда состава (г/л): (NH₄)₂HPO₄ – 0,5; MgSO₄*7H₂O – 0,2; NaCl – 0,1; агар – 15,0; органическая кислота в виде соли Na или К – 2,0; pH 6,8. До стерилизации к среде добавляют 20 мл 0,04% водного раствора индикатора метилрот, который в интервале pH 6,8 – 8,4 изменяет окраску от желтой к красной. Среду разливают в пробирки и стерилизуют при 1 атм. Посев проводят уколом. Продолжительность культивирования от 2 до 14 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов. О потреблении органических кислот свидетельствует рост по уколу и изменение кислотности среды в щелочную сторону, что отчетливо заметно по цвету индикатора.

Некоторые грибы способны использовать и такие химически устойчивые соединения, как углеводороды. Выявить способность микроорганизма окислять жидкие нелетучие углеводороды можно на плотной среде состава (г/л): KNO₃ – 4,0; KH₂PO₄ – 0,6; Na₂HPO₄*12H₂O – 1,4; MgSO₄*7H₂O – 0,8; выщелоченный агар – 2,0; pH 7,2. Среду стерилизуют в колбах при 1 атм. и разливают в чашки Петри толстым слоем. После того как среда застынет, в центре агаровой пластинки вырезают лунку. Для этой цели можно воспользоваться пробочным сверлом (диаметр 8–10 мм), которое предварительно стерилизуют в пламени горелки. Микромицеты высевают радиальными штрихами от лунки к периферии чашки. В лунку вносят 2–3 капли исследуемого углеводорода (стерилизуют фильтрованием). Чашки помещают в термостат строго горизонтально, не переворачивая. Через 7–10 суток отмечают наличие или отсутствие роста по штриху в сравнении с контролем – ростом на среде без углеводорода (Нетрусов, 2005).

2.5 Определение радиальной скорости роста

Определение радиальной скорости роста грибов проводили на плотной питательной среде за определенный промежуток времени. После 48 часов инкубации при 25±2⁰С измеряют диаметр выросших на чашках колоний при помощи линейки. Эту операцию повторяют через каждые двое суток в течение двух недель.

За диаметр отдельной колонии в данный момент времени принимают среднее арифметическое измерение. Вычисление радиальной скорости проводят по формуле:

K_r = (r – r_o) / (t – t_o),

где k – радиальная скорость роста;

r_o – радиус колоний в начальной момент времени t_o;

r – радиус колоний в момент времени t (Паников, 1991).

3. Исследование роста микромицетов рода Aspergillus на различных источниках углеродного питания

Объектами исследования явились различные виды микроскопических грибов рода Aspergillus: A. niger, A. ustus, A. terreus, A. flavus и A. fumigatus. В качестве источника углерода использовали из легкоусвояемых: сахара (сахароза, лактоза, ксилоза, арабиноза, галактоза, мальтоза), многоатомные спирты (глицерин, манит, сорбит), крахмал; из трудноразлагаемых (нефть, целлюлоза, гербицид, пестицид).

В результате посева исследуемых видов Aspergillus на среду Чапека с различными источниками углерода и среду Частухина с целлюлозой было установлено, что изменение экологических условий оказывает существенное влияние на развитие микромицетов. Была изучена способность штаммов использовать различные легкоусвояемые и трудноусвояемые источники углерода методом определения радиальной скорости роста выросших колоний. Оценка возможности потребления различных источников углерода показала, что они способны утилизировать многие источники углеродного питания, но ни один из исследуемых видов не разлагал такие трудноусвояемые вещества, как гербицид и пестицид. Динамика роста видов на разных средах при одинаковых условиях инкубации, не одинакова.

В таблице приложения и на рисунках 1–15 приведены зависимости радиальной скорости роста от времени у изученных грибов на различных источниках углерода.

Рис. 1. Радиальная скорость роста A. niger на сахарах

Уже на первые сутки культивирования A. niger хорошо развивается во всех средах, кроме среды с ксилозой. Затем наблюдается скачок роста на средах с сахарозой и галактозой. К концу времени инкубации скорость роста колоний уменьшается и наибольшей становится на среде с мальтозой. Наибольшие биологические ритмы приходятся на 48–96 ч. и 144–264 ч. времени культивирования.

Рис. 2. Радиальная скорость A. terreus на сахарах

В первые дни культивирования наибольшая скорость роста A. terreus наблюдается на средах с сахарозой, арабинозой и галактозой. Затем происходит скачок роста на средах с сахарозой и арабинозой. На 14-е сутки культивирования наблюдается резкий скачок в росте на среде с галактозой. Биологические ритмы максимальны на 144–264 ч. дни инкубации.

Рис. 3. Радиальная скорость роста A. fumigatus на сахарах

Наибольший рост A. fumigatus наблюдается на среде с сахарозой. Затем на этой среде рост уменьшается и происходит резкий скачок радиальной скорости на среде с арабинозой. К концу времени культивирования наблюдаются наибольшие биоритмы.

Рис. 4. Радиальная скорость роста A. flavus на сахарах

Из данных рисунка 4 видно, что A. flavus хорошо растет на среде с сахарозой. Но к концу культивирования наибольшая скорость роста наблюдается с галактозой. Максимальные биоритмы приходятся на начальный момент времени культивирования – 48–144 ч.

Рис. 5. Радиальная скорость роста A. ustus на различных сахарах

По данным рисунка 5 видно, что наибольшую скорость в течение всего времени инкубации A. ustus проявляет на среде с сахарозой, и резкий скачок в росте наблюдается на среде с галактозой. На протяжении всего времени инкубации рост A. flavus характеризуется высокими биоритмами.

Таким образом, сахара легко усваиваются всеми исследуемыми штаммами. Наибольшие биологические ритмы наблюдаются в течение всего времени экспозиции, как и в начальные часы, так и в конце инкубации.

Рис. 6. Радиальная скорость роста A. niger

Наибольшая скорость роста A. niger наблюдается вначале культивирования на среде с маннитом. Затем скорость роста резко падает и становится минимальной на этой среде. На других источниках углерода также наблюдаются скачки роста, которые к концу инкубации заметно уменьшаются. Максимальные биоритмы приходятся на начальный момент времени культивирования – 48–144 ч.

Рис. 7. Радиальная скорость роста A. terreus

Рост A. terreus наблюдается на всех легкоусвояемых источниках углерода, кроме среды с сорбитом. Вначале и в конце культивирования радиальная скорость роста примерно одинаковая. В середине инкубации наблюдаются скачки роста, особенно на среде с глицерином. Наибольшие биологические ритмы приходятся на 144–264 ч. времени культивирования.

Рис. 8. Радиальная скорость роста A. fumigatus

По данным графика видно, что рост A. fumigatus имеет большие скачкообразные изменения, особенно проявляющиеся на средах с маннитом и глицерином. Наибольшая скорость роста проявляется на среде с маннитом, к середине инкубации наблюдается скачок роста на среде с глицерином. Биологические ритмы характеризуются большими колебаниями и приходятся на середину времени экспозиции – 96 ч. и 216 ч.

Рис. 9. Радиальная скорость роста A. flavus

Радиальная скорость роста A. flavus вначале и в конце культивирования примерно одинаковая. В середине инкубации наблюдаются скачки роста, особенно на среде с крахмалом. Высокие биоритмы наблюдаются на 144–264 ч. инкубации.

Рис. 10. Радиальная скорость роста A. ustus

Наибольшая скорость роста A. ustus наблюдается на средах с маннитом и глицерином. Скорость роста на среде с сорбитом наименьшая и в течение всего времени культивирования значительно не изменяется. Также как и A. fumigatus, A. ustus проявляет большие биоритмы на 144–216 ч.