93239 (Получение антисывороток и поликлональных антител)

Реферат

по биологии

на тему:

"Получение антисывороток и поликлональных антител"

2009

1. Иммуногенность антигенов

Иммуногенность антигена - это способность в организме иммунизированного животного образования антител. Иммуногенность как биологическое свойство антигена является более сложным, чем антигенность. Антигенности того или иного вещества недостаточно, чтобы вызвать образование антител. В качестве примера можно привести гаптены, которые приобретают иммуногенность только после конъюгирования с соответствующим носителем.

Иммуногенность веществ сильно зависит от их молекулярной массы: чем выше молекулярная масса, тем выше иммуногенность. Отсюда вытекает важное практическое следствие - сшивка биополимеров между собой и другими белками повышает иммуногенность. Зависимость иммуногенности от молекулярной массы, по-видимому, определяется следующими причинами: во-первых, увеличение времени пребывания антигена в организме при возрастании его молекулярной массы; во-вторых, у высокомолекулярных антигеноа существенно возрастает способность взаимодействовать с макрофагами, в-третьих, с увеличением молекулярной массы в антигене увеличивается как общее количество антигенных детерминант, так и их разнообразие, что повышает эффективность взаимодействия] антигенов как с B-, так и с T-лимфоцитами.

Плотность расположения и количество антигенных детерминант на поверхности антигенов также имеет важное значение: по мере увеличения этих показателей иммуногенность в начале растет, а затем начинает уменьшаться. Так, например, для динитрофенильной гаптеновой группы было показано, что из конъюгатов, содержащих 3, 16 и 28 групп на молекулу бычьего альбумина, максимальной антигенностью обладал конъюгат, содержащий 16 молекул гаптена. Одной из причин такого эффекта, по-видимому, является сложность межклеточной кооперации. В частности, показано, что в иммунном ответе против антигенов, имеющих повторяющиеся антигенные детерминанты, участвуют только В-лимфоциты; такие антигены называются независимыми. Для этих антигенов, например полимеров. D-аминокислот, также характерно снижение скорости метаболизма в организме.

Очень важным является понятие "чужеродность" иммуногена. Установлено, что чем более антиген отличается по своей структуре от гомологичного антигена иммунизируемого животного, тем выше его иммуногенность. Например, инсулины человека и многих видов животных имеют близкую первичную структуру и поэтому для них инсулин человека малоиммуногенен. Однако между инсулином человека и морской свинки имеются достаточные отличия, что позволяет использовать этих животных как продуцентов соответствующих антисывороток. Однако это правило нельзя считать абсолютным. Так, например, гормон тироксин имеет одинаковую структуру у всех животных, тем не менее, будучи конъюгированным с подходящим белком, он становится хорошим иммуногеном. В данном случае антигенная детерминанта состоит не только из гормона, но и "ножки" и части белковой глобулы, что в целом создает "чужеродную" структуру. Именно на этом принципе основано получение антител против различных низкомолекулярных физиологически активных веществ.

"Чужеродность" зависит от генетических особенностей иммунизируемого животного, поэтому часто иммуногенность связывают с генетической чужеродностью антигена. Из "чужеродности" следует, что иммуногенность - это не абсолютное свойство антигена по отношению к данному виду животного, а иногда даже к индивидуальному организму. Необходимо иметь в виду, что иммунная система организма сама находится под жестким генетическим контролем, который определяет как биологическую активность различных участников иммунного процесса, так и многообразие специфичностей рецепторов, а значит, и специфичностей антител. Именно видовая и индивидуальная вариабельность организмов требует внимательного выбора вида животного. Чем менее "чужеродный" антиген, тем большее количество животных следует брать для иммунизации. Так, например, для получения антисывороток против инсулина наиболее иммунореактивными являются морские свинки, при этом в среднем только одна из семи морских свинок дает удовлетворительную для целей анализа антисыворотку. Даже в случае получения антисывороток против достаточно "чужеродных" антигенов необходима большая группа животных, так как в этом случае нивелируются индивидуальные различия. Смесь антисывороток против данного антигена от разных животных одной группы называют пулом.

Из лабораторных животных чаще всего берут для иммунизации кроликов, морских свинок или мышей в зависимости от количества имеющегося антигена, доступности животного и т.д. Возможность использования группы лабораторных животных позволяет решить проблему отбора из них наиболее иммунореактивных. Иммунизировать удобнее самцов, так как у них иммуногенный ответ менее подвержен влиянию гормональных циклов. Для получения антител против вирусов эффективными оказались куры, у которых антитела накапливаются в яйцах. Большие количества антисывороток получают иммунизацией крупных животных: козлов, баранов, ослов, лошадей.

Для получения специфических антисывороток важное значение имеет гомогенность антигена. Это обусловлено тем, что примеси чужеродных антигенов могут обладать большей иммуногенностью, чем основной антиген, в результате чего, несмотря на небольшое количество примеси, против нее может образоваться достаточное количество антител. Так, например, вирусные антигены, выделенные из культуры ткани животных, содержат примесь тканевых антигенов, против которых вырабатываются антитела, дающие ложноположительные реакции в иммунохимическом анализе.

Степень иммунного ответа также зависит от количества введенного антигена. При определенных концентрациях антигена, как высоких, так и низких, наступает торможение гуморального иммунного ответа, называемое толерантностью. Это обусловливает необходимость выбора оптимальной дозы в каждом конкретном случае, с учетом чистоты препарата и его иммуногенности. Доза иммуногена для одной инъекции кролику или морской свинке составляет в среднем 100-300 мкг на 2 кг массы. Доза, необходимая для крупных животных, не увеличивается пропорционально их массе. Так, для овец достаточна доза, равная 0,25-5 мг иммуногена на инъекцию, для осла - 0,5-10 мг. В случае использования в качестве иммуногена конъюгата гаптенноситель доза зависит от молекулярной массы конъюгата.

Способ введения антигена и периодичность введения влияют на иммунологическую активность антисывороток. Так как иммунный ответ формируется в организме постепенно, принято различать первичный ответ и вторичный ответ. Первичные и вторичные антисыворотки отличаются по составу антител и их специфичности. Обычно высокоактивные антисыворотки получают после нескольких циклов иммунизации. Однако очень длительные иммунизации могут привести к снижению специфичности из-за постепенного увеличения титра антител к примесным антигенам.

В процессе иммунизации изменяется также аффинность и соотношение между различными фракциями антител. Такая вариабельность качества антисывороток по специфичности антител, их физико-химическим свойствам и концентрации является следствием популяционной природы иммунного ответа. В связи с этими обстоятельствами на практике необходимо вести непрерывный контроль за качеством получаемых антисывороток.

2. Получение иммунных антисывороток

Адъюванты - это соединения, которые при введении в организм вызывают неспецифическое усиление иммунного ответа и тем самым повышают способность организма реагировать на любой иммуноген. Адъювантными свойствами обладают масла, липосомы, клетки бактерий, полимеры и др. Адъюванты, введенные в организм вместе с иммуногеном, выполняют две функции. Во-первых, они способствуют более медленному освобождению иммуногена из участков инъекции, что замедляет его поступление в кровоток, в результате чего увеличивается вероятность встречи иммуногена с иммунокомпетентными клетками, а также резко снижается его токсичность. Во-вторых, адъюванты вызывают сильное воспаление в месте введения иммуногена, при этом активируется фагоцитоз и стимулируется местная циркуляция лимфоцитов, происходит неспецифическая стимуляция иммунокомпетентных клеток. Для усиления такой неспецифической иммуностимуляции в состав адъюваитов дополнительно включают препарат бактериальных клеток рода Bacillus pertussium.

В настоящее время для целей иммунизации широко применяется коммерческий препарат полного адъюванта Фрейнда, в состав которого входят смесь минеральных масел, эмульгатор и убитые микобактерии. Препарат адъюванта можно приготовить в лабораторных условиях, тщательно смешав три части минерального масла, одну часть безводного ланолина, четыре части 0,15 M К-фосфатного буфера и препарат микобактерии до конечной концентрации 10 мг/мл так, чтобы частички микобактерии равномерно распределились по всему объему. Адъювант смешивают с водным раствором иммуногена в отношении 2: 1 до образования нерасслаивающейся эмульсии, в которой водный раствор иммуногена находится в мицеллах.

Использование в иммунизации адъюванта снижает возможность появления толерантности, позволяет расширить диапазон вводимого иммуногена от 50 до 200 мкг на одну инъекцию. После введения адъюванта у животных часто образуются гранулемы, которые влияют на самочувствие животных, поэтому в течение иммунизации необходимо тщательно наблюдать за состоянием здоровья животного. В случае ухудшения самочувствия очередную инъекцию пропускают и лишь после выздоровления животного продолжают иммунизацию.

Способы иммунизации. Введение иммуногена приводит к активации лимфоидных клеток, расположенных вблизи от места инъекции. Наиболее эффективно вводить иммуноген малыми порциями в большое количество точек. Введение иммуногена можно осуществлять различными способами.

Внутрикожное введение. На очищенном от шерсти участке кожи животного делают острым скальпелем несколько царапин, а затем втирают в это место раствор иммуногена. Применение этого способа позволяет получать высокий иммунный ответ уже после однократного введения, в результате чего значительно сокращается расход иммуногена. Однако описанный способ трудоемок в исполнении и обычно вызывает сильные болевые ощущения у животного от обширных участков изъязвлений в местах введения иммуногена.

Подкожная иммунизация. В точки, расположенные вдоль позвоночника животного, вводят 5-6 порций раствора иммуногена объемом приблизительно 2 мл.

Внутримышечное введение. Одновременно часть иммуногена вводят в мышцу задних ног животного и небольшими порциями.

Внутрибрюшинное введение. Этот способ используют для иммунизации мелких лабораторных животных, таких, как мыши или морские свинки.

Прямое введение иммуногена в лимфатические узлы. Иммуноген инъецируют в лимфоидные узлы, расположенные в подколенной ямке задних ног кролика, что позволяет уменьшить его количество до 10-50 мкг, а объем вводимого раствора - до 25 мкл. Этот способ является сложным в техническом исполнении, поскольку включает в себя разрез кожи, поиск лимфоузла и введение иммуногена без его повреждения.

Внутривенное введение. Этот способ обычно применяется для повторных инъекций, после которых проводят отбор крови у животного. Раствор иммуногена вводят непосредственно в кровоток. Адъювант в этом способе введения антигена не применяется, поскольку он оказывает токсический эффект и животное может погибнуть.

Более редко используются такие способы иммунизации, как введение иммуногена в подушечки лап или в конъюнктиву глаза, которые вызывают сильные болевые ощущения у животного. Иммунизацию начинают введением животному иммуногена в смеси с полным адъювантом Фрейнда, а для повторных инъекций применяют неполный адъювант Фрейнда. Перед отбором крови за 7 - 9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. Число инъекций и интервалы между ними чаще всего подбираются экспериментально для конкретного иммуногена.

В процессе иммунизации у животных отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства растворимых антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. В том случае, когда иммуногеном являются клетки микроорганизмов, максимально высокий уровень антител наблюдается гораздо раньше. После окончания первого цикла иммунизации животному в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Ниже приводятся схемы иммунизации морских свинок и кроликов инсулином и конъюгатом тироксин - бычий сывороточный альбумин.