91311 (Ефекти, обумовлені введенням у клітини ссавців трансгена аполіпопротеїну А-1 людини), страница 4

ВИСНОВКИ

У результаті виконання дисертаційної роботи досліджено експресію трансгена АРОА1 людини, розміщеного у векторах експресії під регуляцією різних промоторів, у клітинах ссавців in vitro; вивчено тривалість збереження, локалізацію та експресію трансгена in vivo, що був введений ін’єкцією у паренхіму печінки тварин у складі комплексу плазміди pTRhCMV-IEapo з ПЕІ.

1. Вперше сконструйовано серію рекомбінантних плазмід, які містять повнорозмірний варіант гена АРОА1 людини під транскрипційним контролем промоторів hCMV-ІA та CAG: pTRhCMV-IAapo, pTRCAGapo, які, здатні забезпечити високий рівень експресії трансгена в клітинах ссавців.

2. У транзиторній системі експресії для трансфікованих плазмідами pTRhCMV-IEapo та pTRhCMV-IAapo клітин СНО-К1 показано синтез АРОА1 людини на рівні ~ 0,4 нг/мл і ~ 3 нг білка/мл середовища, відповідно.

3. На культурах стабільних трансформантів СНО-К1 підтверджено, що гібридні промотори hCMV-ІA та CAG забезпечують вищий рівень експресії АРОА1 людини порівняно з промотором hCMV-ІЕ.

4. Експериментально показано можливість підвищення рівня експресії трансгенів, які є повнорозмірними геномними варіантами, введенням до складу елементів регуляції транскрипції послідовності інтрону.

5. Продемонстровано, що трансген, введений в організм піддослідних тварин ін'єкцією у паренхіму печінки у складі комплексів плазміди з розгалуженим поліетиленіміном, може потрапляти крім печінки до тканин інших органів, зокрема: легенів, серця, нирок, лімфовузлів та клітин стінки аорти.

6. Встановлено збереження трансгена у клітинах печінки щурів та кролів щонайменше 25 діб та 85 діб у разі введення цільової ДНК ін'єкцією у паренхіму печінки у комплексі з поліетиленіміном.

7. На 6-ту добу після трансфекції плазмідою pTRhCMV-IEapo показано накопичення АРОА1 людини на рівні 1,6-20 мкг/мл у плазмі крові кролів.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гільчук Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К., Кордюм В. А. Вивчення транзиторної експресії гена АРОА1 людини під регуляцією різних гібридних послідовностей в клітинах СНО-К1 // Біополімери і клітина. – 2006. – Т. 22, № 3. – С. 210–217. Особистий внесок здобувача – конструювання рекомбінантних плазмід; визначення рівня синтезу АРОА1 людини клітинами СНО-К1, трансфікованими препаратами ДНК/ПЕІ; ПЛР аналіз трансгена.

2. Гільчук Ю. М., Іродов Д. М., Старокадомський П. Л., Пішель І. М., Топорова О. К., Новікова С. М., Кордюм В. А. Розповсюдження по органам та експресія гена АРОА1 людини у складі введеної плазмідної ДНК in vivo // Біополімери і клітина. – 2006. – Т. 22, № 6. – С. 439 – 445. Особистий внесок здобувача – оптимізація умов проведення ПЛР аналізу гена АРОА1 людини в ДНК трансфікованих клітин кролів та свиней; виділення РНК із зразків печінки кролів; ПЛР аналіз ДНК тканин піддослідних тварин; тестування специфічності зв’язування моноклональних та поліклональних антитіл до АРОА1 людини у плазмі крові різних тварин методом Вестерн-блот аналізу; детекція АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів.

3. Гільчук Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К., Кордюм В. А. Експресія гена аполіпопротеїна А-1 людини під контролем різних регуляторних послідовностей стабільними трансформантами СНО-К1 // Доповіді академії наук України. – 2007. – Т. 23, № 4. – С. 169–172. Особистий внесок здобувача – конструювання рекомбінантних плазмід; дослідження методами ELISA та Вестерн-блот аналізу культуральних середовищ клітин СНО-К1, трансфікованих препаратом ДНК/ПЕІ; проведення ПЛР аналізу ДНК тварин.

4. Гільчук Ю. М., Топорова О. К., Новікова С. М., Кордюм В. А. Вплив введення трансгена аполіпопротеїну А-1 людини на рівень холестерину та морфологію тканин у кролів, які утримувалися на холестериновій дієті // Біополімери і клітина. – 2008. – Т. 24, № 1. – С. 78–81.Особистий внесок здобувача – приготування препарату плазмідна ДНК/ПЕІ.

5. Kordyum V., Toporova O., Novikova S., Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Lihachova L., Morgunov P., Irodov D. In vivo gene transfer of human APOA1 genomic DNA results in markedly high transient expression in model animal // XXX Annual ESAO Congress, Abstract book. – Aachen (Germany), 2003. – P. 664. Особистий внесок здобувача – тестування специфічності зв’язування моноклональних та поліклональних антитіл до АРОА1 людини методом Вестерн-блот аналізу; визначення наявності АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів.

6. Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Suchorada H., Toporova O., Irodov D. Expression of human APOA1 gene in mammalian cells in vitro // Conference for students, PhD students and young scientists, Abstract book. – Kiyv (Ukraine), 2003. – P. 168. Особистий внесок здобувача – визначення методом ELISA рівня синтезу АРОА1 людини трансфікованими клітинами СНО-К1.

7. Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Morgunov P., Toporova O., Irodov D., Novikova S., Kordyum V. Testing of transgene delivery and biodistribution by PCR-analysis // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology, Abstract book. – Lviv (Ukraine), 2004. – P. 226. Особистий внесок здобувача – оптимізація умов ПЛР аналізу гена АРОА1 людини в ДНК трансфікованих клітин щурів; виділення ДНК із зразків тканин різних органів піддослідних тварин; ПЛР аналіз тотальної ДНК тканин різних органів піддослідних щурів.

8. Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Morgunov P., Toporova O., Irodov D., Novikova S. Testing of transgene delivery and biodistribution by PCR-analysis // XXXI Annual ESAO Congress ”Towards medicaltechnology of the future”, Int. J. Artif. Organs. – 2004. –Vol. 27, № 7. – Р. 591. Особистий внесок здобувача – виділення ДНК із зразків тканин різних органів піддослідних тварин; ПЛР аналіз ДНК тканин різних органів піддослідних щурів.

9. Гільчук Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К. Вивчення експресії гена ароА-1 людини під регуляцією різних гібридних послідовностей в СНО-К1 // Матеріали конференції-конкурсу робіт молодих учених, присвяченої 100-річчю від Дня народження В. О. Бєліцера „Актуальні проблеми біохімії та біотехнології – 2006”. – C. 7. Особистий внесок здобувача – конструювання рекомбінантних плазмід; тестування характеристик зв’язування моноклональних та поліклональних антитіл до АРОА1 людини методами ELISA та Вестерн-блот аналізу; дослідження культуральних середовищ клітин СНО-К1, трансфікованих препаратом ДНК/ПЕІ.

10. Novikova S., Toporova O., Gilchuk Iu., Kordyum V. Non-viral gene delivery of human APOA1 into mammalian cells in vitro and in vivo // XIV Annual Congress of the European Society of Gene Therapy, Abstract book. – Athens (Greece), 2006. – Р. 157. Особистий внесок здобувача – ПЛР аналіз ДНК трансфікованих клітин; виявлення АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів та культуральному середовищі трансфікованих клітин.

АНОТАЦІЯ

Гільчук Ю. М. Ефекти, обумовлені введенням у клітини ссавців трансгена аполіпопротеїну А-1 людини. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 – молекулярна генетика. – Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2008.

Дисертацію присвячено дослідженню ефектів, обумовлених введенням плазмідної ДНК з геном АРОА1 людини, на культурі клітин та тваринах. У результаті роботи сконструйовано серію рекомбінантних плазмід, які містять геномний варіант гена АРОА1 людини під регуляцією промоторів hCMV-ІЕ, hCMV-ІA та CAG. При дослідженні пулів стабільно трансфікованих клітин СНО-К1 показано, що промотори hCMV-ІA та CAG забезпечують вищий рівень експресії АРОА1 людини порівняно з hCMV-ІЕ. Виявлено, що трансген, введений в організм піддослідних тварин ін'єкцією у паренхіму печінки у складі комплексів плазміди з поліетиленіміном (ПЕІ), потрапляє крім печінки до інших органів. А також, зберігається у клітинах печінки щурів та кролів щонайменше 25 діб та 85 діб, відповідно. Встановлено, що введення гена АРОА1 людини під контролем hCMV-ІЕ, у складі комплексів з ПЕІ у печінку кролів, призводить до накопичення АРОА1 людини у крові тварин та зниження рівня атеросклеротичного пошкодження тканин досліджуваних органів і вмісту тотального холестерину у крові порівняно з контрольною групою кролів при утримані тварин на холестериновій дієті.

Ключові слова: аполіпопротеїн А-1, поліетиленімін, трансген, експресія.

АННОТАЦИЯ

Гильчук Ю. Н. Эффекты, обусловленные введением в клетки млекопитающих трансгена аполипопротеина А-1 человека. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 – молекулярная генетика. – Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертация посвящена исследованию эффектов, обусловленных введением плазмидной ДНК с геном АРОА1 человека, на культуре клеток и животных. В результате работы сконструировано серию рекомбинантных плазмид, содержащих геномный вариант гена АРОА1 человека под регуляцией промоторов hCMV-ІЕ, hCMV-ІA и CAG. При исследовании пулов стабильно трансфицированных клеток СНО-К1 показано, что промоторы hCMV-ІA и CAG обеспечивают более высокий уровень экспрессии АРОА1 человека в сравнении с hCMV-ІЕ. Продемонстрировано, что трансген, введенный в организм животных инъекцией в паренхиму печени в составе комплексов плазмиды с полиэтиленом, попадает кроме печени в другие органы. А также сохраняется в клетках печени крыс и кролей наименьше 25 и 85 суток, соответственно. Установлено, что введение гена АРОА1 человека под контролем hCMV-ІЕ, в составе комплексов плазмида/ПЕІ в печень кролей, приводит к накоплению АРОА1 человека в крови животных и снижает уровни атеросклеротического повреждения исследуемых органов и содержания тотального холестерина в крови животных в сравнении с контрольной группой кроликов при содержании кролей на холестериновой диете.

Ключевые слова: аполипопротеин А-1, полиэтиленимин, трансген, экспрессия.

SUMMARY

Gilchuk Iu. M. The effects caused by injection of human apolipoprotein A-1 transgene into mammalian cells. – Manuscript.

Thesis for a Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality 03.00.22 – molecular genetics. – Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.

The elaboration of methods of genes delivery into somatic cells is the foundation of gene therapy development. There is necessity to develop new and more effective vectors as well as corresponding methods of gene delivery into target tissues. The plasmid vectors, which may be applied at cells transfection by physical or chemical methods, do not have disadvantages, inherent to virus vectors, though they are characterized by much lower effectiveness of transfection in vivo in comparison with the latter at their usage for genes transfection in vivo. The analysis of distribution of plasmid molecules in tissues and transgene expression are constituent parts of valuation of effectiveness of gene therapy methods for a target gene delivery. To correct disorder, caused by the deficiency of expression of a specific gene in the organism, high level of expression of a target transgene is often necessary to achieve physiological concentrations of the protein and therapeutic effect correspondingly. It was shown that the expression level of genes, introduced into mammalian cells, depends on many reasons, including the strength of transcription regulatory elements. One of the perspective strategies of solving the problem, connected with a low level of transgenes expression, is optimization of already known regulatory sequences and search for stronger ones. To some degree it might solve the problem of low effectiveness of cells transfection by the plasmid vectors.