91311 (Ефекти, обумовлені введенням у клітини ссавців трансгена аполіпопротеїну А-1 людини), страница 3

Ген АРОА1 людини виявлено в клітинах печінки всіх щурів піддослідної групи на 3-ю та 25-у добу після ін’єкції, у той час, як при подальшому аналізі на 90-у добу, трансген не виявлений в усіх проаналізованих тварин (табл. 1). Одержаний результат може свідчити про те, що у зазначений період часу після ін’єкції препарату ДНК/ПЕІ відбуваються процеси, що призводять або до зменшення у клітинах плазмідної ДНК до рівня, який нижчий за чутливість методу аналізу, або до загибелі трансфікованих клітин. Варто зазначити, що в усіх випадках трансген виявляли лише за результатом другого раунда ампліфікації, однак при цьому спостерігали гетерогенність проб за кількістю синтезованого амплікону та за наявністю чи відсутністю продукту першого раунда ампліфікації.

Таблиця 1

Тривалість знаходження трансгена АРОА1 у тотальній ДНК клітин печінки щурів, визначена методом «nested » ПЛР

Дослідження наявності гена АРОА1 людини у тотальній ДНК клітин печінки кролів виявило тривале збереження цільової ДНК в клітинах (табл. 2). Так, трансген виявляли і на 85-у добу після введення ДНК, в той час, як на 150-у добу АРОА1 людини не детектували. Через годину після введення плазмідної ДНК у паренхіму печінки трансген був детектований у першому раунді «nested» ПЛР, в той час, як в усі наступні часові періоди його наявність детектували за продуктами другого раунда ампліфікації. При цьому не спостерігали значної гетерогенності за кількістю продуктів ампліфікації, що можна значною мірою пояснити особливістю аналізу наявності гена АРОА1 людини саме з використанням пар праймерів Ap(h-Rab)-f/Ap(h-Rab)-r та Ap(h-PigRab)-f/Ap(h-PigRab)-r: було показано інгібування другого раунда ПЛР з використанням прймерів Ap(h-PigRab)-f/Ap(h-PigRab)-r при більшій за 10⁶ кількості копій цільової ДНК у реакційній суміші.

Таблиця 2

Тривалість знаходження трансгена АРОА1 у тотальній ДНК клітин печінки кролів, визначена методом «nested » ПЛР

Встановлення локалізації введеного трансгена in vivo. Дослідження розповсюдження плазмідної ДНК в органах піддослідних тварин проводили на щурах та кролях, яким ін’єкцією в паренхіму печінки вводили препарат ДНК/ПЕІ. Тварин забивали на 6-у та 85-у добу після ін’єкції плазміди pTRhCMV-IEapo. Для проведення аналізу відбирали у щурів проби тканин печінки, серця, легенів та нирок, а у кролів, окрім цих органів − також лімфатичні вузли та стінку аорти.

За допомогою підібраних для кожної з тварин наборів праймерів проведено «nested» ПЛР аналіз наявності гена АРОА1 людини у тотальній ДНК, що була виділена з тканин різних органів щурів та кролів. За результатами другого раунда «nested» ПЛР встановлено наявність трансгена в усіх проаналізованих зразках тканин тварин (табл. 3) (чутливість «nested» ПЛР у присутності ДНК щура 10 копій гена АРОА1 людини/500 нг ДНК, у присутності ДНК кроля − 10³ копій гена/500 нг ДНК). Це свідчить про ефективність доставки плазмідної ДНК ін’єкцією in vivo у складі комплексів ПЕІ/ДНК.

Таблиця 3

ПЛР аналіз розповсюдження в організмі піддослідних тварин гена АРОА1 після введення плазмідної ДНК

Примітки: + трансген виявлено; – трансген не виявлено; н/п – дослідження не проводили.

Результати аналізу локалізації трансгена in vivo показали, що частина плазмідної ДНК, яку було введено в печінку, потрапляє з міжклітинною рідиною та лімфою, або через капіляри з венозною кров’ю, у кровообіг, і таким чином, розповсюджується по організму. Але в даному випадку, методом ПЛР, важко визначити, чи потрапляє плазмідна ДНК у клітини тканин інших органів (серце, легені, нирки, лімфовузли), чи виявляється лише плазмідна ДНК, яка знаходиться у крові в капілярах цих органів або у клітинах ендотелію судин. Звичайно, при локальному введенні плазмідної ДНК з катіонними ліпідами спостерігають зберігання переважної кількості трансгена біля місця введення (Eliyahu et al., 2007), що з високою вірогідністю вірно і для комплексів ДНК/ПЕІ. Однак, використаний нами для аналізу локалізації трансгена метод «nested» ПЛР, з метою підвищення чутливості аналізу, не дозволяє робити висновок щодо кількісного розподілу введеної плазміди та відображає лише якісно здатність трансгена потрапляти до певних тканин організму після введення плазміди запропонованим нами методом.

Дослідження синтезу АРОА1 та очікуваного терапевтичного ефекту при повторних введеннях плазміди pTRhCMV-IEapo тваринам. Вивчення ефектів, обумовлених введенням трансгена АРОА1 людини in vivo здійснювали на експериментальній моделі атеросклерозу, яку одержували при утримуванні кролів на холестериновій дієті. Відомо, що метаболізм ліпопротеїдів кролів більш подібний до метаболізму людини порівняно з метаболізмом мишей та щурів (Moghadsian et al., 2001). Саме тому кролі з експериментально індукованим атеросклерозом є адекватною моделлю для вивчення ефектів від введення трансгена людини на метаболізм ліпопротеїдів та сприйнятливості до атеросклерозу. При утриманні кролів на холестериновій дієті вже на другий тиждень спостерігається зростання вмісту холестерину у крові піддослідних тварин і надалі таке зростання продовжується щонайменше 4 місяці (Цинциадзе и соавт., 1981). Це призводить до гістологічних та морфологічних змін тканин органів, зокрема: печінки, легенів, нирок, серця, стінок судин та інших. Виходячи з вищезазначеного, у даній роботі аналізували вплив введення у складі комплексів з ПЕІ трансгена АРОА1 людини на вміст тотального холестерину у плазмі крові, морфологію тканин печінки, серця та стінки аорти у кролів з експериментально індукованим атерослерозом.

Досліди проводили на кролях, які були поділенні на дві групи: тваринам першої групи (n=4) тричі вводили плазміду pTRhCMV-IEapo, дотримуючись проміжку один місяць між ін’єкціями; другій, контрольній, групі (n=4) вводили плазміду pTR, що не містить цільовий ген за такою ж схемою. Після першого введення плазмідної ДНК всіх кролів утримували на холестериновій дієті. На шосту добу після кожного введення препарату плазмідної ДНК у тварин відбирали кров для аналізу наявності АРОА1 людини. Одночасно визначали концентрацію тотального холестерину у плазмі крові тварин.

Для імунохімічного визначення вмісту АРОА1 людини у плазмі крові піддослідних кролів досліджували специфічність комерційних моноклональних та поліклональних антитіл проти АРОА1 людини та оптимізували метод Вестерн-блот аналізу.

З використанням методу Вестерн-блот аналізу на шосту добу після першої ін’єкції препарату ДНК/ПЕІ в плазмі крові трьох тварин першої групи було виявлено АРОА1 людини, в той час, як у плазмі тварин контрольної групи він не визначався (рис. 6). Порівняння рівнів експресії трансгена показало, що концентрація АРОА1 людини в плазмі крові відрізнялась від тварини до тварини і становила від ~ 1,6 мкг/мл до ~ 20,2 мкг/мл.

Аналіз зростання рівня тотального холестерину у плазмі крові тварин виявив достовірні розбіжності між контрольною та піддослідною групами тварин (табл. 4, рис. 7).

Таблиця 4

Зростання рівня холестерину у кролів, яким вводили плазміди, %

Попередні результати морфологічного дослідження тканин кролів контрольної групи виявило потовщення інтими у ділянці дуги аорти, а у тканинах печінки − інфільтрацію ліпідами різного ступеня в центральних та периферійних зонах органа. У той же час аналіз тканин кролів, яким водили плазміду pTRhCMV-IEapo, не виявив атеросклеротичних змін аорти та печінки тварин (рис. 8).