91281 (Дослідження механізму дії гіпервисокочастотного випромінювання на загоювання шкірних ран в експерименті), страница 2

- ХХVІ Міжнародній науково-практичній конференції „Применение лазеров в биологии и медицине” (Ялта, 10-13 жовтня 2006 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 наукових робіт, серед яких 4 статті у фахових наукових медичних виданнях, які входять до переліку ВАК України, 7 – тези доповідей та одержано 1 деклараційний патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Матеріали дисертації викладено на 119 сторінках друкованого тексту і містять: вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів дослідження, 4 розділи результатів власних експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення результатів, висновки, список використаних літературних джерел (119, з яких 89 кирилицею та 30 латиницею). Матеріали проілюстровано 21 рисунком та 14 таблицями.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експерименти проведені на 176 білих лабораторних щурах-самцях масою 180-220 г (популяція експериментальної біологічної клініки ДУ “Інститут патології хребта та суглобів ім. проф. М.І. Ситенка АМНУ”). У дослідних серіях щурів і відповідній їм контрольній серії тварини-аналоги підбирались одної статі та віку з відхиленнями живої маси не більш як на 7-10 г. Догляд та всі маніпуляції з тваринами проводили згідно з правилами Європейскої конвенції з захисту хребетних тварин (European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. – Counsil of Europe. Strasburg, 1986). Досліди проводили протягом першої половини дня з 10 до 14 години.

У відповідності до поставлених задач роботи тварини були розподілені на 6 груп:

І група – 36 щурів з неінфікованими ранами шкіри, опромінених ГВЧ випромінюванням з густиною потоку енергії 4 Вт/м² (400 мкВт/см²);

ІІ група – 36 щурів з неінфікованими шкірними ранами, опромінених ГВЧ випромінюванням з густиною потоку енергії 8 Вт/м² (800 мкВт/см²);

ІІІ група – 36 щурів з неінфікованими ранами шкіри, опромінених ГВЧ випромінюванням з густиною потоку енергії 16 Вт/м² (1600 кВт/см²);

IV група – 40 щурів з інфікованими золотавим стафілококом шкірними ранами, опромінених ГВЧ випромінюванням з густиною потоку енергії 4 Вт/м² (400 мкВт/см²);

V група – 14 неопромінених щурів з неінфікованими ранами шкіри;

VI група – 14 неопромінених щурів з інфікованими ранами шкіри.

У І-ІІІ групах піддослідних тварин виділяли по 3 підгрупи у залежності від кількості проведених сеансів опромінення (табл. 1):

А – 2 сеанси опромінення,

Б – 3 сеанси опромінення,

В – 7 сеансів опромінення.

У підгрупах А та Б частину щурів не виводили з досліду після закінчення опромінення, а доводили до 8 доби з часу першого опромінення.

Дослідження у IV групі тварин (інфікована рана) проводили після досліджень загоєння неінфікованої рани.

У IV групі щурів було виділено 2 підгрупи у відповідності до числа сеансів опромінення (табл. 1):

А – 3 сеанси опромінення,

Б – 7 сеансів опромінення.

У підгрупі А частину щурів не виводили з досліду у час закінчення опромінення, а доводили до 11 доби після його початку.

Усім щурам проводили однотипові планіметричні, гістологічні, біохімічні дослідження. Тваринам з інфікованими ранами шкіри додатково проводили цитологічні обстеження ранового ексудату та імунологічні дослідження.

114 тваринам моделювали шкірну рану неінфіковану (умовно чисту, з незначним бактеріальним забрудненням) та 54 - інфіковану (гнійну). Під загальним тіопенталовим наркозом на поверхні шкіри щурів (на шкірі верхньої третини правого стегна) виконували рановий дефект у формі кола діаметром 15 мм, глибиною до фасції. До ран щурів, котрим виконували модель гнійної рани, через 60-90 хвилин по операції вносили по 0,02мл мікробної суміші з фізіологічним розчином монокультури золотавого стафілокока (штам Staphylococcus aureus АТСС 25923) з розрахунку 500 млн. мікробних тіл в 1 мл суміші (тобто 0,02 мл суміші вміщували 10 млн. мікробних тіл). З наступної доби після створення ран їх опромінювали шляхом сканування ранової поверхні з відстані 20 мм впродовж 15 хв гіпервисокочастотним випромінюванням у режимі безперервної генерації з густиною потоку енергії 4, 8 та 16 Вт/м² – дворазово (з інтервалом 1 день), триразово (щодня) та семиразово (з інтервалом в 1 день після 4-го сеансу). Тварин протягом сеансу опромінення фіксували на спеціальній дощечці, шляхом привязування за кінцівки. Щурам контрольної групи виконували тільки фіксацію.

Джерелом ГВЧ випромінювання з довжиною хвилі 0,337 мм для дослідів служив стаціонарний HCN-лазер проточного типу з системою напуску газу і квазіоптичним хвилеводним трактом. Застосований лазерний комплекс був спеціально створений для біомедичних досліджень в Інституті радіофізики та електроніки ім. О.Я.Усікова НАН України (м.Харків).

Тварини були виведені з експерименту шляхом передозування ефіру в різні терміни дослідження, в залежності від намічених завдань – після закінчення 3, 5, 8 та 11 діб з часу першого опромінення.

У роботі використані планіметричні методи (методика Попової Л.М.) (1979) для дослідження динаміки змінення площі ран. Площу ран виражали у мм². Для встановлення достовірних відмінностей при аналізі цифрових показників були застосовані методи варіаційної статистики з використанням прикладного пакету Statsoft Statistica 6,0 for Windows.

Цитологічні дослідження ексудату ран виконували за методом Покровської М.П. та Макарова М.С. у модифікації Штейнберга Д.М., котрий полягає у кількісній оцінці головних клітинних елементів, що зустрічаються у рані, за рановими відбитками на предметному склі зі складенням цитограм.

Застосування кількісної оцінки препаратів-відбитків дозволяє значно підвищити інформативність та об'єктивізацію методу Покровської М.П. та Макарова М.С.

Для гістологічного дослідження виділяли ділянку шкіри з раною і фіксували у розчині нейтрального формаліну з масовою часткою 5%. Матеріал зневоднювали у спиртах зростаючої міцності та заливали у целоїдин. Гістологічні зрізи забарвлювали гематоксилін-еозином та за методом Ван-Гізон.

Щурам, котрим були створені штучні інфіковані рани, виконували бактеріологічне обстеження ранового вмісту у відповідності з Наказом № 535 МОЗ СРСР “Об унификации микробиологических методов исследований” від 22.04.85 р.

Бактеріологічні посіви проводили у такі терміни:

наприкінці 1 доби після виконання моделі рани та її інфікування до опромінення; після 1, 2, 4 та 6 діб з моменту початку ГВЧ-терапії.

Згідно з вимогами вищезгаданого Наказу № 535 рановий вміст відбирали стерильними ватними тампонами і робили посіви на такі поживні середовища: на цукрово-мясний бульйон, на чашки Петрі з 5% кровяним агаром та з жовточно-сольовим агаром (середовище Чистовича). Посіви інкубували у термостаті при температурі 37С впродовж 20-24 годин. Після інкубації оцінювали інтенсивність росту мікрофлори на чашках Петрі.

Кількісну оцінку вмісту мікрофлори у рановому виділенні проводили у відповідності з п.3 “Инструкции по организации и проведению эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями в акушерских стационарах”, що є додатком до Наказу № 691 МОЗ СРСР від 28.12.89 р., згідно з якою вираховували кількість мікробів і визначали її у колонієутворюючих одиницях (КУО).

У якості діагностичних тестів була досліджена ціла низка біохімічних показників, що відображали стан основних видів обміну тварин в умовах даного експерименту.

Стан білкового обміну визначали за вмістом загального білка (біуретовим методом), білкових фракцій (методом електрофорезу), за активністю аланін– (АлАТ) і аспартатамінотрансфераз (АсАТ) (метод Райтмана і Френкель) (Карпищенко А.И., 2002).

Вуглеводний обмін оцінювали на основі визначення глюкози в сироватці крові глюкооксидазним методом (Камышников В.С., 2003); обмін гетерополісахаридів досліджували за рівнем хондроїтинсульфатів в реакції помутніння сироватки з риванолом (Левченко В.И. и соавт., 2004); глікопротеїнів – за методом С.Я.Штейнберг та Я.Н.Доценко (1982).

Таблиця 1. Схема експерименту: розподіл щурів за групами та підгрупами з урахуванням інтенсивності випромінювання і за кількістю опромінень

Оцінку азотистого обміну проводили за допомогою визначення рівня вмісту креатиніну в сироватці крові за кольоровою реакцією Яффе за методом Поппера та співавт., а також вмісту у ній сечовини фотометричним методом з діацетилмонооксимом (Камышников В.С., 2003).

З метою оцінки впливу ГВЧ випромінювання на стан клітинного імунітету проведено дослідження динаміки вмісту у крові щурів ефекторних клітин запалення (лейкоцити, нейтрофіли), клітин лімфоїдного ряду, поглинальної і перетравлювальної здатності фагоцитуючих нейтрофілів периферійної крові щурів після індукції запального процесу та 3, 8 та 11 добу після початку його лікування (для контрольних тварин ці терміни фактично відповідали 4, 8 та 12 добі).

Кількість лейкоцитів підраховували у камері Горяєва, відсотковий вміст у крові лімфоцитів і нейтрофілів визначали загальноприйнятим методом шляхом підрахунку лейкоцитарної формули (Петров Р.В. и соавт., 1989).

Поглинальну і перетравлювальну активність нейтрофілів периферійної крові щурів визначали у відношенні до тест-культури умовно-патогенного штаму золотавого стафілокока С-52 після їх сумісної інкубації протягом 30 хв. при 37°С, шляхом оцінки забарвлених мазків, виготовлених з лейкоцитарно-мікробної зависі (Карпищенко А.И., 2002).

Поглинальну здатність нейтрофілів периферійної крові оцінювали за фагоцитарним числом (відсоток фагоцитуючих нейтрофілів на 100 клітин) і фагоцитарним індексом (середня кількість мікробів, поглинених 1 активним нейтрофілом).

Результати досліджень оброблено за методом варіаційної статистики з використанням пакету аналізу Microsoft Excel XP.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Першим етапом експерименту було вивчення впливу ГВЧ випромінювання на загоєння неінфікованих, “чистих” шкірних ран з випробуванням густин потоку його енергії 4, 8 та 16 Вт/м².

Проведені планіметричні дослідження показали, що лазерне опромінення з використанням вказаних режимів (4, 8 та 16 Вт/м²) по-різному впливає на темпи загоєння ран. Позитивний вплив ГВЧ випромінювання на загоєння шкірних ран, який відобразився більш швидкими темпами зменшення площі ран по відношенню до контролю, зареєстровано при застосуванні випромінювання з густиною потоку енергії 4 та 8 Вт/м². Найменші площі шкірних ран на 5 добу були у щурів після 5 сеансів опромінення (рис.1), а на 8 добу дослідження були у щурів після 7-разового опромінення з густиною потоку енергії 4 Вт/м² (рис.2). При режимі опромінення з густиною потоку енергії 16 Вт/м² темпи загоєння ран у тварин усіх трьох підгруп ІІІ групи практично не відрізнялись від швидкості загоєння у контрольних.