18835-1 (Диагностика стафилококковых инфекций)
Описание файла
Документ из архива "Диагностика стафилококковых инфекций", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "медицина" из , которые можно найти в файловом архиве . Не смотря на прямую связь этого архива с , его также можно найти и в других разделах. Архив можно найти в разделе "рефераты, доклады и презентации", в предмете "медицина, здоровье" в общих файлах.
Онлайн просмотр документа "18835-1"
Текст из документа "18835-1"
Диагностика стафилококковых инфекций
Выполнил: Новак А.Л., 301 гр., л/ф, Владивосток, 1998.
Предисловие
Несмотря на то, что стафилококки принадлежат к числу наиболее легко обнаруживаемых и распознаваемых микроорганизмов, не требующих сложных диагностических приемов для их выявления, в практической работе микробиологи до сих пор испытывают определенные трудности при установлении их причинной роли в ряде различных заболеваний. С одной стороны, присутствие патогенных стафилококков, обнаруживаемое в исследуемом материале, не всегда является убедительным доказательством их этиологического значения.
С другой, учитывая большое разнообразие проявлений биологической активности этих микробов, зависящее от разных, не всегда поддающихся учету факторов, широкую их изменчивость под влиянием лекарственных веществ и самого макроорганизма, довольно сложно бывает определить их потенциальную патогенность. Наконец, третья причина связана с тем, что стафилококки являются представителями нормальной микрофлоры из группы условно патогенных микроорганизмов и, наряду с непатогенными, патогенные представители обитают в организме людей, распространяясь при этом весьма неравномерно на разные участки человеческого тела. Если выделение патогенного стафилококка, из крови больных людей и различных полостей, которые принято считать стерильными, в подавляющем большинстве случаев может служить доказательством его роли как возбудителя болезни, то присутствие стафилококков на слизистых зева, носа и т. д. даже при явном болезненном состоянии их требует большой осторожности исследователя в выводах об этиологии данных заболеваний.
Поэтому, естественно, не может быть общих рекомендаций, как при диагностике различных стафилококковых инфекций, так и при микробиологических исследованиях участков тела человека и разных объектов внешней среды. Широкий обмен мнениями между микробиологами научных учреждений и практических лабораторий, осуществляемый на съездах и конференциях, посвященных проблемам стафилококковых инфекций, а также при личных контактах, казалось бы, должен был привести к определенным взглядам на различные методы исследования, предлагаемые для выделения и идентификации стафилококков. Однако большое число запросов, поступающих из лабораторий СЭС и лечебных учреждений, свидетельствует о явных затруднениях, которые возникают у исследователей при решении разных вопросов микробиологической диагностики стафилококков, а в ряде микробиологических учреждений бытуют еще некоторые устаревшие методы и приемы, приводящие к неправильным оценкам и даже досадным недоразумениям.
Важным условием эффективности лабораторной диагностики является сочетанное определение качественных и количественных критериев содержания патогенных стафилококков в исследуемом материале. Исходя из этого, я считаю необходимым изложить ряд методов основных микробиологических исследований, наиболее простых и доступных для каждой практической и научной лаборатории, которыми мы пользуемся в течение многих лет.
ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВ
Предварительная диагностика стафилококков может основываться на бактериоскопическом изучении препаратов - мазков, окрашенных по Граму. Патогенные стафилококки, помимо гроздевидного расположения, характеризуются правильной сферической формой клеток. Обнаружение стафилококков, находящихся внутри клеток, позволяет дать ответ о наличии стафилококковой инфекции. В большинстве же случаев для точного установления патогенности обнаруженных стафилококков требуется выделить эти микроорганизмы в чистой культуре путем посева исследуемого материала на плотные питательные среды. В настоящее время ассортимент дифференциальных, элективных и накопительных сред, предложенных для выделения патогенных стафилококков, весьма значителен и продолжает расширяться.
Многие исследователи на основе знания основных биохимических характеристик и питательных потребностей патогенных стафилококков при конструировании сред стремятся повысить их высеваемость и обеспечить возможность осуществлять их количественный учет, получить надежный способ отличать потенциально болезнетворные стафилококки от сапрофитов. Употребление жидких накопительных сред для перви гемолитическую активность стафилококков. При этом необходимо помнить, что гемолитическая способность, определяемая на чашках с кровяным агаром, зависит от многих факторов - вида крови, ее концентрации, наличия в ней антитоксинов, толщины слоя среды, содержания углекислого газа в атмосфере культивирования, густоты посева, присутствия и характера сопутствующей флоры и т. д.
При отборе колоний с кровяного агара необходимо отвивать как гемолитические, так и не дающие гемолиза, особенно если исследование проводится на среде с человеческой или лошадиной кровью, а отсутствие гемолиза на таких средах не позволяет заключить об отсутствии вообще гемолитической активности. Поэтому использование кровяного агара для первичного посева целесообразно только при обследовании объектов, не содержащих посторонней микрофлоры, и желательно добавлять в питательную среду кровь кролика или барана.
Если же проводится исследование гноя открытых ран или отделяемого язв или свищей, то следует пользоваться элективно-дифференциальной средой для стафилококков - желточно-солевым агаром (ЖСА) Г. Н. Чистовича. Элективность этой среды обеспечивается высоким содержанием хлористого натрия, а добавленный яичный желток позволяет выявлять лецитовителлазную активность, которая является одним из показателей патогенности стафилококков и в силу этого ЖСА более четко дифференцирует патогенных представителей, чем кровяной агар. Приготовление ЖСА несложно. Заготовляют впрок и стерилизуют в автоклаве при 120 °С" в течение 20 мин питательный агар (МПА или Хоттингера) рН 7,2-7,4, содержащий 10% поваренной соли. Перед употреблением солевой питательный агар растапливают, остужают до 45-50 °С и добавляют к нему 20% по объему стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 200 мл физиологического раствора). Для лучшего эмульсирования желательно иметь колбы со стеклянными бусами. После тщательного перемешивания среду разливают по 20-25 мл в чашки, которые могут храниться в холодильнике в течение нескольких дней. Следует производить массивный посев исследуемого материала на чашки с ЖСА, а инкубацию вести в течение 2 суток при 35-37° С. Посторонняя флора резко подавляется, стафилококки же на ЖСА вырастают практически в чистой культуре. Непосредственно при просмотре чашек вокруг колоний отмечается образование радужных венчиков и мутной зоны - лецитовителлазная реакция. Такие колонии, не менее двух из каждого посева, отвивают на скошенный мясо-пептонный агар для последующей проверки выросших культур в реакции плазмо-коагуляции.
Чтобы избежать ошибок в определении желточной реакции, необходимо иметь в виду, что иногда наблюдается помутнение среды без радужного ободка, в этом случае проба на лецитовителлазу считается отрицательной. Если же колонии, выросшие на ЖСА, не дают лецитовителлазной реакции, т. е. не окружены радужным венчиком, но имеется рост стафилококков, то их тоже считают подозрительными и также отвивают не менее двух из каждого такого посева на чашки с простым питательным агаром пятнами диаметром 5-10 мм. После суточного инкубирования при 37° С полученные макроколонии проверяют в реакции плазмоагглютинации, для чего микробную массу размешивают петлей на стекле в каплях цитратной кроличьей или человеческой плазмы, разведенной 1 :4. Образование хлопьев учитывают в течение 30с-1 мин. При наличии плазмоагглютинации такие штаммы считают подозрительными и отвивают на скошенный агар для дальнейшего изучения в коагулазной реакции.
При таком отборе число пропускаемых штаммов патогенных стафилококков человеческого происхождения невелико, культуры же, выделенные от животных, требуется проверять в реакции плазмокоагуляции. Коагулазная проба является основным признаком, определяющим болезнетворность стафилококков, поэтому ее постановка требует к себе максимального внимания. Для выявления коагулазной активности у стафилококков, выделенных от людей, можно пользоваться как цельной кровью, так и плазмой кроликов или человека. Можно использовать также кровь или плазму, взя результатов проводится обязательно дважды: через 2-3 ч и 24 ч. Учитывают свертывание плазмы и образование сгустков. Обычно культуры, активно продуцирующие коагулазу, дают положительную реакцию уже через 2-3 ч. а если они обладают и выраженной фибринолитической активностью, то первоначально образовавшиеся сгустки могут подвергнуться расплавлению к концу суток. Слабокоагулирующие штаммы могут давать положительную реакцию в поздние сроки-к концу суток. Опыты, давшие сомнительный результат, необходимо повторить.
Некоторые исследователи, получив отрицательный или сомнительный результат, оставляют пробирки на столе. Этого делать нельзя, так как свертывание плазмы в более поздние сроки может носить не специфический характер и его не следует принимать во внимание. Стафилококки, дающие положительную коагулазную пробу, должны рассматриваться как потенциально патогенные, независимо от наличия или отсутствия у них гемолитических свойств и характера пигмента, их относят к виду St. aureus и в дальнейшем подвергают фаготипизации и проверке на чувствительность к антибиотикам. Углубленное изучение стафилококков показало, что основной признак па-тогенности - коагулазная реакция может подвергаться изменчивости при воздействии различных факторов (Г. Н. Чистович, 1961; Е. М. Падерина, 1966), поэтому в ряде случаев, при выделении коагулазонегативных стафилококков в монокультуре из патологических очагов, целесообразно изучить у них другие признаки потенциальной болезнетворности и прежде всего - способность ферментировать маннит в анаэробных условиях.
Известно, что среди коагулазоотрицательных часть культур обладает способностью расщеплять маннит в анаэробных условиях (8,4% -по данным А. А. Акатова и М. Л. Хатеневер, 1974). Определение ферментации маннита в анаэробных условиях технически очень просто и осуществляется путем посева уколом исследуемых культур в пробирки с высоким столбиком полужидкого агара Хоттннгера, содержащего 1% маннита и 0,004% индикатора бромкрезолпурпура или бромтимолблау (рН == 7,2). Эту среду перед посевом "регенерируют", т. е. кипятят в водяной бане, быстро охлаждают, а после посева заливают слоем стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 5 дней. Однако в значительном числе случаев результаты могут быть учтены уже через сутки. Наряду с реакцией плазмокоагуляции, большое значение приобрела еще одна важная способность стафилококков, характеризующая их потенциальную патогенность, -дезоксирибонуклеазная активность.
Многие исследователи сообщают о высокой корреляции этого признака с коагулазной активностью и токсигенностью изучаемых культур; отмечают, что стафилококки, выделенные из патологического материала, как правило, обладают ДНК-азой. Коагула-зопозитивные штаммы, полученные от носителей, могут не иметь этого фермента, и обычно отсутствие дезоксирибонуклеазной активности сочетается с низкой биохимической способностью и атоксигенностью таких культур стафилококков. По наблюдениям некоторых исследователей, среди коагулазонегативных штаммов стафилококков, но обладавших другими признаками патогенности, выделенных в ряде случаев от больных с различными гнойными инфекциями, дезоксирибонуклеазную активность проявляли от 10 до 29% таких культур (И. И. Панышева и сотр., 1967; Franklin и соавт., 1966; Lierd и Golde, 1970).
В настоящее время этот тест может служить надежным дифференциальным признаком между патогенными и непатогенными стафилококками и в то же время может помочь в дифференциации степени патогенности коагулазопозитивных штаммов и, безусловно, привлечет внимание к коагулазонегативным, но обладающим этим ферментом культурам стафилококков и в ряде случаев позволит отнести последние к болезнетворным формам с большей уверенностью. Методика определения дезоксирибонуклеазной активности несложна, в основу ее положен метод Джеффриса. Готовят впрок 2% МПА (рН-8,6), содержащий ДНК (2 мг/мл среды), разливают по флаконам и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин. Перед разливом в чашки к среде добавляют CaCIa (0,8 мг/мл). На подс деполимеризации ДНК. После 18-20-часовой инкубации поверхность агара заливают 5 мл IN раствора НС1 и через 3-5 мин учитывают зоны просветления. Реакции оценивают в крестах.
При этом следует учесть, что интенсивность зоны деполимеризации на плотной среде не всегда совпадает с количеством продукции этого фермента у исследуемых стафилококков в жидких средах. Для обнаружения фибринолизина используют несколько усовершенствованный метод Кристи с сотр. Среда Кристи-Чепмена имеет следующий состав: мясной экстракт-0,45 г, пептон-0,75 г, хлористый натрий-1,2 г, агар-2,75 г, вода-130 мл, рН среды == 7,0. Стерилизуется в автоклаве и сохраняется впрок. Перед опытом среду растапливают, остужают до 50 °С и добавляют 15-20% стерильной цитратной человеческой плазмы. Смесь прогревается в водяной бане при 65-70°С в течение 2- 5 мин до появления ясной мути, а затем разливается в чашки. Испытуемые культуры засевают "пятнами" по 15-20 на чашку. Посевы инкубируют при 37 °С. Учитывается образование зон просветления вокруг колонии первоначально через 14 ч, затем через 24 и 48 ч, так как реакция у различных культур течет неодинаково быстро и у ряда штаммов она развивается в более поздние сроки. Фибринолитический тест мы считаем весьма пригодным для определения потенциальной болезнетворности стафилококков, но оцениваем только в комплексе с другими признаками активности. Гиалуронидазная активность определяется по методу Мак-Клина в модификации М. Ш. Могилевского и Л. С. Коган (1949). Раствор гиалуроната дающий в присутствии 2 N уксусной кислоты типичный сгусток, разливается по 0,5 мл в стерильные пробирки. Добавляется 0,5 мл суточной культуры стафилококка в пептонной воде. Контролями служат: гиалуропат + дистиллированная вода и гиалуропат + незасеянная среда. Смеси встряхиваются и выдерживаются при 37 °С 15-20 мин. Затем в каждую пробирку добавляется по две капли 2 N раствора уксусной кислоты и встряхивается. В контролях должен образоваться слизистый комочек. В опыте при наличии гиалуронидазы он отсутствует, что свидетельствует о деполимеризации гиалуроновой кислоты микробным ферментом.