Глик, Пастернак - Молекулярная биотехнология - 2002, страница 6

д.) — выбор системы зависит от целей эксперимента. Характер биологической системы исключительно важен л~тя биотехнологического процесса. Во многих случаях именно генетически модифицированная самовоспроизводящая биологическая единица — микроорганизм, вирус, растение или животное — является конечным коммерческим продуктом. Среди множества биологических объектов, использующихся в молекулярной биотехнологии, основными «рабочими лошадками» являются бактерии Езс»гепсЬа ео»г, одноклеточные дрожжи оаес»гагоогуеех сегеггхгае и различные клеточные липни животного происхождения. Все они и»рвот важную роль в получении белков, колируемых клонированными генами. В последующих главах мы летально опишем различныее высокоспециализированные биологические системы.

В частности, в гл. 7 будет рассмотрена сисзема «вирус насекомых — клетки насекомых«, которая используется для продукции аутентичных белков, кодируемых клонированными генами, а в гл. 19- генетическая модификация домашних животных (коров, овец, свиней). В наспгящей главе мы дадим краткое описание наиболее значимых лля молекулярной биотехнолопги систем, коюрые также будут рассматриваться в последующих главах.

Все живые организмы делятся на две основные группы: прокариоты и эукариоты. В основе этой классификации лежат многочисленные структурные различия, на которых мы остановимся более детально в последуюгцих главах, а здесь укажем лишь основные нз них: 1) наличие или отсутствие ядра, содержащег о хромосомную ДНК; 2) строение и химический состав клеточной стенки и 3) наличие или отсутствие субклеточных цитоплазматических органелл.

В прокариотической клетке, например бактериальной, хромосомная ДНК находится непосредственно в цитоплазме, клетка окружена ригидной клеточной стенкой, в состав которой часто входит пептидогликан, но не хитин или целлюлоза; в клетке нет субклеточных цитоплазматнческих органелл. В эукариотической клетке имеется ядро, отделенное от питоплазмы ядерной мембраной, хромосомная ДНК нахолится в ядре; клеточная стенка, если она есть, может содержать хитин или целлюлозу, но не пептидопгикан; в цитоплазме содержатся различные субклеточные органеллы (митохондрии, аппарат Голъджи, хлоропласты в клетках растений) (рис.

2.1). Бактерия Исйепс»гга со»г' — один из наиболее хорошо изученных организмов. За последние пятьдесят лет удалось получить исчерпывающую информацию о ее генетике, молекулярной биологии, биохимии, физиологии и общей биологии. Это грамотрицательная непатогенная подвижная палочка ллиной менее 1 мкм. Ее средой обитания является кишечник человека, но она также может высеваться из почвы и воды. Благодаря способности размножаться простым делением па средах, содержащих только ионы 1)а', К«, Мяг", Саг«, )х1Н4+, С1, НР04~ и $04~", микроэлементы и источникуглерода (например, глюкозу), Е. сор ста- Ьиоз!огические системы, используюшисся и молекулярной биотехнологии 25 Хромосома Наружная мембрана Г!ериплазматическое пространспю Клеточная стенка Плазматнческая мембрана Цитоплазма Рибосомм Плазматическая тчпиарат Гольдин Лизосома Ядро цитоплазма Митохондрии Рис.

2.1. Схематическое прелставление прокариотической бактериальной клетки (А) и зукариотической живот- ной клетки (Б). ла излюбленным объектом научных исследований. При культивировании Е.сод на обогашенных жидких питательных средах, содержащих аминокислоты, витамины, соли, микроэлементы и источник углерода, время генерации (т. с. время между образованием бактерии и ее делением) в логарифмической фазе роста при температуре 37 С составляет примерно 22 мин.

Для каждого живого организма сушествует определенный температурный интервал, оптимальный для его роста в размножения. При слишком высоких температурах происходит ленатурация белков и разрушение других важных клеточных компонентов, что ведет к гибели клет- ки. При низких температурах биологические процессы существенно замедляются или останавливаются совсем вследспзие структурных изменений, которые претерпевают белковые молекулы. Исходя из температурного режима, который предпочитают те илн иные микроорганизмы, нх можно подразделить на термофилы (от 45 до 90 "С и вьзше), мезофилы (от 10 до 47 С) н психрофилы, или психротрофы (от — 5 до 35 'С). Микроорганизмы, активно размножа>ощисся лишь в определеупюм диапазоне температур, могут быть полезныл! инструментом для решения различных бисугехнологических задач.

Например, термофилы часто служат источником генов, кодирузощих 26 !ЛАВА 2 в смешанной культуре биохимических мутантов бактерий ,,' Появление новых генотипов 1. Ьег)егвегж Е.1. Та!цгп Сон Зргоеа!!а!6оо Зрмр Оооо!. ВГо!. 11: ! !3— ! !4, !946 В 1946 г. Ледерберг и Татум пролсмонстрировали, что между членами генетически неоднородной популяции Е. сод может происходить обмен генетической информацией и по при этом, как и у двуполых организмов, в результате Физического обмена между хромосомами л!огуг возникать новые генетические комбинации (генетическая рекомбинация).

Обнаружение этого замечательного Феномена выдвинуло Е. сов на передний Фронт генетических исслеловапий. Лелерберг и Татум создали различные шгаммы Е. сой, индуцнруя зс или иные мутации и отбирая клетки с разнообразными наследуемыми дефектами метаболизма. 11апример, олна чистая кулыура могла синтезировать вешества А, В н С, но не О или Е (се обозначили АВС!)е). Параллельно созвали другую чистую культуру, абсОЕ. Смешав зти культуры, получили бактерии АВСЕ!Е. Ки в олной из чистых кул!лур лип АВСОЕ нс возникал спонтанно.

Экспериментально тсрмоствбнльныс ферменты, коп>рые применяются в промышленных нлн в лабораторных процессах, а генетически видоизмененные психротрофы используют для биодеградацнн токсичных отходов, содержащихся в почве н воде, при пониженных температурах. Е. гоб можно культивировать как в азробных (в присутствии кислорода), так н в анаэробных (без кислорода) условиях. Однако для огпнмальной продукции рекомбннантных белков Е. соб н другие микроорганизмы обычно выращивают в а>робных условиях. Если целью культивирования бактерий в лаборатории является синтез и выделение определенного белка, то культуры выраш!!да!от на сложных жидких питательных средах в колбах.

Для поддержания нужной темпера- туры н обеспечения достаточной аэрации культу- ральной среды колбы помешагсгг в воляную баню илн тсрмостатнруемую комнату н непрерывно встряхивают. Такой аэрации достаточно дчя размножения клеток, но нс всегда — для синтеза белка. Рост клеточной массы н продукция белка лнмнтнруются не содержанием в питательной среде источников углерода нли азота, а солержаннем растворенного кислорода: прн 20 С оно равно примерно девяти миллионным долям. Это становится особенно важно прн промышленном получении рекомбинвнтнь!х белков с гюмощью лсгчкроорганнзмов.

Для обеспечения условий, оптимальных для максимальной продукции белков, конструируют специальные фермептеры н создают системы аэрации. По !ти до середины ХХ в. среди бактериологов господствовало мнение, что в отличие от других >ливых организмов бактерии при неблагоприятных внешних воздействиях вьпкивакп не благоларя случайным генетическим изменениям (мутациял!), а вследствие того, что именно эти возлействия в болыиинстве случаев запускают физиологические процессы, которые и позволяют бактериям выжить. З!.а теория была опровергнута исследованиями С.Е.

Лурия и М. Дел ьбрюка (1 нпа >ЕЕ.. Ос1Ьгасй М., беаевсз 28! 49! — 5! 1, 1943). которые доказали, что устоичивость Е. соя к бактериальныл! вирусам (бактериофа!ам) обусловлена именно произошслшими в них мутациями„а нс реакцией бактерий на воздействие со стороны бактсриофага. Эти ланные нашли подпюржлепие в работах других а!хгоров, из> !ааших последствие других неблагоприятных внешних возлейсгвий. Исслег!ования Лурия — Дельбрюка положили начало современной генетике микроорганизмов.

исключив осгальные возможные причины образования кол!бипапии АВСОЕ, Лелсрберг и Та!ум пришли к выволу, что она возникает в результате Физического обмена генетическим материалом между двумя хромосомами. Другими словами, у Е. сов суцсествуст некое подобие аппарата полового размножения, который, как н у лругих организмов, обеспечивает создание новых комбинаций генов. Как заявил Лурия, это открытие может стать «олнил! из наиболее великих достижений за всю историю развития бактериолои!и», что впоследствии и подтвердилось. Вско1ю появилась целая серия блестяшнх работ самого Ледсрберга и др>гих авторов, которые позволили установить, как работает генетическая система Е. со(!.

Этот микроорганизм !Ннроко испо!!Ьзовался как модельная система шш изучения молекулярных основ синтеза нуклеиновых кислот и белков, а также лругих важнейших биологических процессов. биологические системы, использу>ошиеся в молекулярной биотехнологии 27 Ассе>поп>ип> свгуе >испит Напйи > Ьге>В На>она >им>д> Гииаля а>иппхпепе>> Сьг»пеьас>епив Хйаатгсип> Сгп>п>а Ьегм ой> ЬмЬепсьт сой Рти>>оп>ооа > ерр.

ЛЬ>сомов про. й>ге>ипт>сее ерр. !псьодеппо гете! хап>ьо>попа> сатре>>н> Ууво>попа> тоьйв 'тасс)>атотусез сетсрыае Табаияи 2. I. Некоторые генетически модифицирован- ные микроорганизмы, исцоль>унхциеея в био>ехнологии Помимо Е. сай, н молекулярной биотехнологии используют множество других микроорганизмов (табл. 2.1). Их можно разделить на дне группы: микроорганизмы как источники специфических генов и микроорганизмы, созданные генноинженерными методами для решения определенных задач.

К специфическим генам относится, например, ген, кодирующии термостабильную ДНК- полимеразу, коп>рая используется н широко применяемой полимеразной цепной реакции (ПЦР). Зтог ген был выделен из термофильных бактерий и клонирован в Е. сой. Ко второй г рупие микрооршнизмов относятся, например, различные ппаммы СагупеЬ>ктепиш Х!шат(сит, которые были генетически модифицированы с цельк> повышения продукции промыв>лепно важных аминокислот.