ВКР: Идентификация белков, взаимодействующих с теломерными последовательностями в ДНК и РНК.

Содержание







Список сокращений................................................................................................................. 3

Введение................................................................................................................................... 4

1. Обзор литературы............................................................................................................. 5

1.1. Структура и функции теломер..................................................................................... 5

1.2. Репликация теломерных областей............................................................................. 10

1.3. Структура хроматина теломерных областей............................................................ 13

1.4. Транскрипция теломерных областей и РНК TERRA.............................................. 14

1.5. Теломерные последовательности вне теломер и их функции................................ 14

1.6. Подходы к изучению теломерных последовательностей....................................... 18

2. Цель работы........................................................................................................................ 20

3. Задачи работы.................................................................................................................... 20

4. Материалы и методы......................................................................................................... 21

4.1. Материалы................................................................................................................... 21

4.1.1 Штаммы, использованные в работе..................................................................... 21

4.1.2. Среды, использованные в работе........................................................................ 22

4.1.3. Плазмиды, использованные в работе................................................................. 22

4.1.4. Олигонуклеотиды, использованные в работе.................................................... 23

4.2. Выделение белков, взаимодействующих с РНК, содержащей человеческие

теломерные повторы в дрожжевой системе.................................................................... 25

4.3. Масс-спектрометрия................................................................................................... 27

4.4. Метод ПЦР................................................................................................................... 27

4.5. Рестрикция плазмид UIRL-lacO-25-12-8 и UIRL-lacO-25-12-5 рестриктазой SmiI

28

4.6. Дрожжевая трансформация........................................................................................ 28




1























2

Список сокращений

ALT – alternative telomere lengthening (альтернативное удлинение теломер)

BIR – breakage-induced replication (индуцированная двунитевыми разрывами репликация)

ITSs – interstitial telomeric sequences (внутренние, интерстициальные теломерные последовательности)

ITL – interstitial telomere loop (внутренняя теломерная петля)

MALDI - matrix assisted laser desorption/ionization (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, МАЛДИ)

PBS - Phosphate buffered saline (Натрий фосфатный буфер)

SILAC - stable isotope labeling with amino acids in cell culture (маркировка (метка) стабильными изотопамиаминокислот в клеточной культуре

STARs - subtelomeric antisilencing regions (субтеломерные анти-сайленсинговые регионы)

TAS – telomeric associated sequences (последовательности, ассоциированные с теломерами)

TPE – telomeric position effect (позиционный эффект теломер)

TTI – targeted telomere insertion (таргетная вставка теломерных последовательностей)

QTIP - quantitative telomeric chromatin isolation protocol (количественный метод выделения теломерного хроматина)

БСА - бычий сывороточный альбумин ИПТГ - изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид

















3

Введение

Теломеры представлены нуклеопротеиновыми комплексами, сформированными концевыми участками линейных хромосом и взаимодействующими с ними белками, основной функцией которых является защита концов хромосом от систем рекомбинации и репарации двунитевых разрывов ДНК. Последовательность ДНК теломер у большинства видов эукариот представлена короткими гуанин-богатыми тандемными повторами, которые также обнаруживаются во внутренних частях хромосом и известны как интерстициальные теломерные последовательности (от англ. interstitial telomeric sequences, ITSs). Теломерные последовательности ассоциированы с областями с повышенной геномной нестабильностью, а также в силу высокого содержания гуанина и особенностей хроматиновой укладки являются сложными матрицами для работы систем репликации и репарации ДНК. Теломерные последовательности на концевых и внутренних участках хромосом вовлечены в взаимодействия с различными белками, участвующими в регуляции транскрипции проксимальных и дистальных генов и других внутриядерных процессах. Изучение теломер и теломерных последовательностей является непростой задачей для исследователей. В последнее время накапливается все больше данных о разнообразных белках, вовлеченных в процессы функционирования теломерных последовательностей в геноме, но многие участники и детали этих процессов до сих пор остаются мало изученными. Разработка методов для эффективного выделения и идентификации белков, вовлеченных в функционирование теломерных последовательностей, является одной из важных задач современной науки. Основой для таких методов могут служить относительно простые и удобные для генетических манипуляций дрожжевые системы. Подобные методы были разработаны и использованы в данной работе для выделения и идентификации белков, взаимодействующих с теломерными последовательностями в ДНК и РНК.