Аналитические характеристики сенсоров

2.5 аналитические характеристики сенсоров

Для каждого нового метода анализа требуется определить его аналити-
ческие характеристики. Метод должен надежно работать не только в ру-
ках разработчика, но и там, где он реально будет применяться — воз-
можно, в руках медсестры или медика-лаборанта. Путь от разработки
метода до его выхода на рынок обычно занимает много времени.

Разработчик нового сенсора должен отдавать себе отчет в том, для
каких задач будет применяться сенсор и каким требованиям он должен
удовлетворять.

2.5.1 Селективность

Для сенсоров селективность — это основная аналитическая характеристика. Сенсоры, дающие отклик только на одно вещество, встречаются очень редко. Проще найти сенсор, отклик которого на определяемое вещество значительно превышает отклики на возможные примеси. С другой стороны, имеются сенсоры, селективные по отношению к
группе веществ сходной химической структуры, например, к карбо-
нильным соединениям.

Ионоселективные электроды. Ионоселективные электроды дают основной отклик только на какой-либо один ион. При этом практически всегда другие ионы создают в них более или менее значительные помехи. Эти помехи характеризуются с помощью коэффициента селективности, и соответствующие данные заносятся в таблицы (табл. 2.1). Такие сведения должны присутствовать и в сопроводиительной документации на   продаваемые электроды.

Коэффициент селективности для каждой пары ионов нахо-
дят из уравнения Никольского—Айзенмана:

где: Е — электродный потенциал; k_ij — коэффициент селективности;
п - заряд определямого иона с активностью a_i; z - заряд постороннего
иона с активностью a_j.

Рекомендуемые материалы

Таблица 2.1. Диапазоны измерений и коэффициенты селективности для некоторых ионоселективных электродов

Значение k_ij определяют, измеряя потенциал ячейки «в двух точ-
ках». Сначала потенциал ячейки измеряют в растворе, где присутствуют
только ионы определяемого вещества (допустим, в концентрации
0,001 М). При этом получают значение Е₁. Затем измеряют значение по-
тенциала E₂ в растворе, в котором помимо основных ионов в той же
концентрации (0,001 М) присутствуют посторонние ионы в более высо-
кой концентрации (например, 0,1 или 0,01 М). Значения потенциалов
определяются следующими уравнениями:

(2.2), (2.3)

Вычитая уравнение (2.2) из уравнения (2.3) и исключая логарифмы,
получим:

где S — наклон калибровочной кривой, полученной в растворе
основного аналита (в идеальном случае он равен 59/n, мВ); d_i — скор-
ректированная активность определяемых ионов в смеси ионов.

Из таблицы 2.1. видно, что коэффициент селективности для гид-
роксид-ионов в присутствии фторид-ионов составляет 0,1. Это значит,
что если помимо фторид-ионов в концентрации C_F в растворе имеются
гидроксид-ионы в концентрации С_он = 10*C_F, значение потенциала
возрастет вдвое, то есть гидроксид-ионы создают значительные помехи
при измерении. Однако эти помехи легко устранимы: достаточно доба-
вить в испытуемый раствор буферный компонент и снизить рН до 5.
При этом концентрация гидроксид-ионов снизится до 10^-9М, что в 1000
раз меньше предела обнаружения фторид-ионов данным ИСЭ.

При измерениях с помощью ИСЭ важно следить за тем, чтобы ион-
ная сила во всех испытуемых растворах была одинаковой, для чего используют корректоры ионной силы. В ряде случаев следует также позаботиться о дополнительных мерах предосторожности. Так, в случае
фторидного ИСЭ следует закислить испытуемый раствор. С другой сто-
роны, для удаления ионов алюминия и железа, которые образуют ком-
плексы с фторид-ионами, в раствор следует добавить достаточно силь-
ный комплексон (например, цитрат). Таким образом, в случае опреде-
ления фторид-ионов с помощью ИСЭ корректор помимо 0,1 М NaCl
(для создания нужной ионной силы) должен содержать 0,01 М цитрата
натрия (для удаления ионов А1 и Fe), а его рН следует довести до 5,5 (для
снижения концентрации гидроксид-ионов).

Ферменты. В качестве распознающих элементов в биосенсорах чаще всего используют ферменты. Селективность биосенсора определяется характеристиками фермента, в том числе его активностью по отношению к субстрату. В ряде случаев их селективность может быть очень высокой.
Так, глюкозооксидаза обеспечивает очень высокую селективность сенсора по отношению к глюкозе в крови, где присутствуют и другие углеводы. С другой стороны, полифенолоксидазы катализируют окисление
целого ряда фенольных соединений сходной структуры. Например, под
действием тирозиназы (продажной полифенолоксидазы, выделяемой
из грибов) разные фенольные соединения окисляются в разной степе-
ни. В то же время полифенолоксидаза из банана не катализирует реак-
цию окисления тирозина и фенола.

В ряде ситуаций широкий спектр действия фермента может иметь
преимущества. Так, в пивоваренной промышленности биосенсоры на
основе полифенолоксидаз применяются для определения общего уров-
ня полифенолов, поскольку от него зависит прозрачность напитка.

Антитела. Из всех биологических материалов наибольшей селективностью характеризуются антитела, которые могут быть получены по гибридомной технологии практически против любого антигена. С помощью антител можно различать даже изомеры одного и того же низкомолекулярного соединения. Антитела лучше всего использовать, когда стоит задача высокоселективного определения конкретного вещества, например, содержания определенного антибиотика в мясе. Вместе с тем, в ряде случаев столь высокая селективность имеет свои недостатки.

Рецепторы. Рецепторы начали использовать в качестве распознающих элементов от носительно недавно. Эффект, возникающий при связывании лиганда с рецептором, зависит от природы лиганда. Например, 17-(3-эстрадиол, связываясь с эстрогеновым рецептором, вызывает значительно более сильный эффект, чем эстрогеновые миметики типа этоксилатов алкили
рованных полифенолов. Поэтому сенсоры на основе рецепторов удобно
применять для выяснения степени антиэстрогеновой активности данно-
го соединения в известной концентрации. Вместе с тем, для определения
концентрации веществ лучше применять методы иммуноанализа.

Другие методы селективного определения веществ. Определять вещества с высокой селективностью позволяют спектро-
скопические и хроматографические методы. В качестве примеров мож-
но привести такие мощные методы анализа, как газовая или жидкос-
тная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией. Селективные
сенсоры часто применяют в качестве детекторов при высокоэффектив-
ной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), например, для определения
полифенолов в пиве. При этом в качестве детектора применяют сенсор
на основе полифенолоксидазы.

2.5.2 Чувствительность

Рабочий диапазон, линейный диапазон и предел обнаружения. Для любого аналитического метода важно знать диапазон концентраций определяемого вещества, в котором этот метод работает (рабочий диапазон). Кроме того, с точки зрения пользования калибровочной
кривой важно знать, в каком диапазоне измеряемый сигнал линейно
зависит от концентрации аналита (линейный диапазон). Достоверно
определяемое данным методом нижнее значение концентрации назы-
вают пределом обнаружения. Способ его определения из калибровочной кривой в соответствии с рекомендациями ИЮПАК показан на рисун-
ке 2.18. Из рисунка видно, что предел обнаружения определяется как
точка пересечения линейного участка калибровочной кривой и базовой
линии, соответствующей той области концентраций, в которой вообще
не возникает сигнала.

Рис. 2.18. Калибровочный график, полученный с помощью нитрат-
селективного электрода. Показано, каким образом определяют
предел обнаружения

Требования к рабочему диапазону определяются конкретной зада-
чей. Например, для измерения уровня глюкозы в крови рабочий диапа-
зон метода должен включать все те значения концентрации глюкозы,
которые встречаются как у здоровых людей, так и у диабетиков, то есть
составлять от 0,2 до 20 мМ (в идеальном случае от 0,1 до 50 мМ).

Для потенциометрических сенсоров линейный диапазон обычно
достаточно велик. Например, протон (рН)-селективные электроды ра-
ботают в диапазоне от рН 0 до рН 12, то есть покрывают 12 порядков
концентрации протонов. Рабочие диапазоны для других ионоселектив-
ных электродов значительно меньше, но все равно составляют 6—7 по-
рядков концентрации (табл. 2.1).

2.5.3. Временные характеристики

Сенсор должен характеризоваться коротким временем отклика (то есть
в нем должен быстро возникать сигнал при контакте с определяемым
веществом) и коротким временем регенерации (то есть он должен быстро возвращаться в исходное состояние после такого контакта). К сожалению, эти требования не всегда удовлетворяются. Кроме того, у большинства химических сенсоров и биосенсоров не слишком большие
сроки эксплуатации. Их важно знать, и не использовать сенсор по
окончании этого срока.

Время отклика. Время отклика — это время, требующееся для того, чтобы аналитическая система или устройство пришли в состоянии равновесия с определяемым веществом. Показано, например, что для получения воспроизводимых результатов при измерении концентрации нитрата нитрат-селективным электродом последний нужно опустить в испытуемый раствор примерно на 30 с. Для биосенсоров время отклика, как правило, выше, чем для химических сенсоров. При слишком высоких време-
нах отклика метод может оказаться непригодным для рутинных измере-
ний. Вместе с тем, в случае сенсоров большое время отклика часто с
лихвой окупается простотой измерения и минимальными требования-
ми к подготовке образца. Времена отклика биосенсоров могут изме-
няться от нескольких секунд до нескольких минут. Время отклика в
5 мин обычно считается допустимым; 10 мин для времени отклика — это
слишком много.

Время регенерации. С временем отклика тесно связана другая характеристика сенсора — время регенерации. Это время, требующееся для полного восстановления сенсора после контакта с определяемым веществом. Часто под временем отклика понимают время, необходимое для измерения сигнала и регенерации сенсора. Во многих работах его вообще
не приводят, а в качестве временной характеристики сенсора дают
количество образцов, которое можно проанализировать за 1 час.
В конце концов, именно этот параметр наиболее важен.

Время жизни. Все сенсоры могут эксплуатироваться в течение ограниченного времени. Даже у наиболее надежных рН-электродов рабочие характеристики ухудшаются после нескольких месяцев эксплуатации.

Время жизни сенсора можно определять несколькими способами.

С одной стороны, можно периодически измерять отклик сенсо-
ра при его непрерывном использовании и постоянном контакте с
определяемым веществом. Тогда за время жизни можно принять тот
срок эксплуатации сенсора, после которого его отклик падает на за-
данную величину (например, на 5 %).

С другой стороны, под временем жизни можно понимать макси-
мальный срок хранения сенсора, готового к эксплуатации (возмож-
но, в буферном растворе или в корректоре ионной силы). В этом слу-
чае время жизни зависит оттого, насколько хорошо при использова-
нии сенсора соблюдаются инструкции производителя.

Наконец, за время жизни можно принять и максимальный срок
хранения сухого сенсора в заводской упаковке (в случае ионоселективных электродов) или максимальный срок хранения охлажденного биологического материала (в случае биосенсоров).

Большинство органических веществ со временем разрушается. Это особенно касается биологических материалов, изъятых из
их природного окружения. Понятно поэтому, что основной недостаток биосенсоров состоит в малых временах жизни используемых в них биологических материалов. Главнейшим этапом в разработке новых биосенсоров является изучение вопроса о том, как
меняется отклик биосенсора на стандартный образец за разные
промежутки   времени   (часы,   дни   и   месяцы).   Как   правило, наименьшей стабильностью характеризуются очищенные фер-
менты, а наибольшей — тканевые препараты.

Разработаны методы, позволяющие увеличить время жизни
биосенсора за счет добавления к раствору фермента специальной
смеси и повышения его стабильности. Показано, что таким обра-
зом действует смесь диэтиламиноэтилдекстрина (ДЭАЭ-декстри-
на) и многоатомного спирта лактикола при ее добавлении в рас-
твор алкогольдегидрогеназы или пероксидазы хрена. При этом
увеличивается стабильность ферментов как при высушивании,
так и при тепловом стрессе. Аналогичным образом названные до-
бавки действуют и в отношении двенадцати других изученных
ферментов.

Влияние названных добавок изучено и для двух биосенсоров
для определения спирта. В обоих в качестве фермента использова-
ли алкогольдегидрогеназу.

В одном случае фермент иммобилизовали на мембране, а по-
лученный биосенсор использовали для амперометрического
окисления перекиси водорода.

В другом случае алкогольдегидрогеназу иммобилизовали
вместе с пероксидазой на электроде, модифицированном N-ме-
тилфенотиазином (NMP) и тетрацианохинодиметаном
(NMP-TCNQ).

И в том и в другом случае стабилизаторы позволили значи-
тельно повысить срок хранения биосенсора в сухом виде при 37 °С.
Точно такой же эффект достигался и для биосенсора на основе
L-глутаматоксидазы и графитового электрода, модифицирован-
ного NMP-TCNQ.

Менее успешны оказались попытки повысить стабильность
биосенсора на основе глюкозооксидазы и угольно-пастового
электрода, модифицированного диметилферроценом. При этом в
качестве добавки использовали только ДЭАЭ-декстрин. Хотя в
лиофилизированном виде глюкозооксидазу можно хранить очень
долго (2 года при О °С и 8 лет при —15 °С), в растворе при рН < 2 и
рН > 8 она быстро теряет активность. Лучше всего она хранится в
растворах с рН около 5.

2.5.4. Прецизионность, точность и воспроизводимость

Любой аналитический прибор, в том числе и сенсор, должен обеспечивать достаточную для поставленной задачи прецизионность. Это
значит, что случайные ошибки измерения не должны превышать заданный порог, а результаты измерений должны быть воспроизводимы. Кроме того, сенсор должен обеспечивать точность измерения, то есть получаемый результат должен быть близок к истинной величине.
Это означает, что систематическая ошибка измерений не должна превышать определенное значение. Особенно важно проверять точность
в случае биосенсоров, поскольку различия в биологическом материале
могут быть причиной систематической ошибки. Важно быть уверен-
ным, что сенсор дает воспроизводимые результаты с достаточной точ-
ностью в течение заявленного срока эксплуатации. Соответствующие
методы проверки подробно описаны во многих книгах (например,
| Miller and Miller, 1993]).

Результат анализа имеет ценность лишь в том случае, если можно
оценить погрешность аналитического устройства. Это касается как химических сенсоров, так и биосенсоров. Для большей достоверности получаемых данных можно несколько раз считывать показания сенсора
для одного и того же образца. Еще лучше повторить всю серию измерений. Из полученных в серии измерений данных можно определить
стандартное отклонение, например, с помощью карманного научного
калькулятора. При необходимости построения калибровочной кривой
и наличии достаточного количества данных можно произвести их линейную аппроксимацию методом наименьших квадратов; при этом вычисляется наклон прямой, отсекаемые на осях ординат отрезки, стандартное отклонение и коэффициент корреляции. Такую аппроксимацию позволяют делать многие научные калькуляторы и  пользовательские приложения типа Microsoft Excel. Несколько более сложно, но очень важно проводить корреляцию между двумя наборами данных. В этом случае стандартными статистическими методами рассчитывают относительное стандартное отклонение. Для биосенсоров расхождения между разными сериями измерений не должны превышать 5-10 %.

Во многих случаях можно обойтись без построения полной калибровочной кривой, а вместо этого применять метод стандартной добавки или многократных стандартных добавок. В методе стандартной добавки сначала проводят измерения в растворе с неизвестной концентрацией аналита, а затем к этому раствору добавляют стандартный
раствор с известной концентрацией аналита. При этом концентрация
аналита в стандартном растворе примерно в два раза превышает предполагаемую неизвестную концентрацию. После этого проводят второе измерение. Важно понимать, что этот метод можно применять
лишь в том случае, если отклик сенсора линейно зависит от концентрации аналита.

Допустим, при неизвестной концентрации аналита C_U отклик сен-
сора составляет r_U:

(2.4)

После добавления в испытуемый раствор стандарта S отклик сенсо-
ра составит r_{(U + S)}:

(2.5)

Здесь АС — изменение концентрации аналита после добавления
стандартного раствора.

При делении уравнения (2.5) на (2.4) получим:

Простое преобразование этого уравнения дает:

В методе многократных стандартных добавок в образец добавляют несколько аликвот стандартного раствора и каждый раз проводят
измерения. Затем строят график зависимости отклика сенсора от
прироста концентрации. Неизвестную концентрацию С_U определяют как точку пересечения полученной прямой с осью абсцисс
(рис. 2.19).

Если имеет место логарифмическая зависимость между концентра-
цией аналита и откликом сенсора (как в случае потенциометрических
сенсоров), удобнее пользоваться графиком Грана. Действительно, по-
тенциал на электроде определяется выражением:

Это выражение легко преобразовать к виду:

График Грана строят в координатах 10^E/S — ΔС. Из этого графика
легко определить С_U как точку пересечения полученной прямой с осью
абсцисс.

Рис. 2.19 Определение катехола в пиве с помощью метода многократной стандартной добавки

2.5.5  Факторы, влияющие на характеристики
сенсоров

Количество фермента. Может показаться, что поскольку ферменты выступают в роли катализатора, а сами в ходе реакции не потребляются, для работы биосенсора неважно, каково количество (или концентрация) иммобилизованного фермента. Однако это не так. Как следует из уравнения Михаэлиса-Ментен,скорость ферментативной реакции прямо
пропорциональна концентрации фермента:

Люди также интересуются этой лекцией: Лекция 21 - Синтез цифровых САУ с цифровыми регуляторами.

Ясно, что для обеспечения приемлемой скорости реакции требуется определенное количество (или суммарная активность) фер-
мента. В случае малой удельной активности препарата может потре-
боваться значительное количество биоматериала, что уменьшает
скорость массопереноса (главным образом, скорость диффузии)
электроактивного вещества к трансдьюсеру. Это обстоятельство
редко упоминается в публикациях, посвященных биосенсорам. Из
таблицы 4.3 видно, что при трехкратном увеличении количества иммобилизованной уреазы (с 25 до 75 ME) значительно возрастает вре-
мя жизни биосенсора для определения мочевины. Несколько увеличиваются время отклика и предел обнаружения. В целом, влияние количества иммобилизованного фермента на характеристики био-
сенсоров изучено недостаточно.

Метод иммобилизации. Напомним, что химические методы (ковалентное связывание и сшивка) могут увеличить стабильность биосенсора, но отрицательно сказываются на времени отклика, поскольку не позволяют реагирующим веществам быстро диффундировать. О физических метопах иммобилизации можно сказать обратное. Нередко при
химической иммобилизации нарушается конформация фермента и
падает его активность, что ведет к ухудшению характеристик сенсора. С другой стороны, менее прочная связь между ферментом и носителем в случае физической иммобилизации (адсорбции, включении
и др.) часто ведет к вымыванию фермента и уменьшению суммарной
активности.

рН буфера. Обычно рН испытуемого раствора нужно тщательно контролировать. Чаще всего используют фосфатный буфер с рН 7,4. Однако оптимальный рН испытуемого раствора зависит оттого, какой медиатор переноса электронов используется в биосенсоре. На примере ряда биосенсо-
ров с глюкозооксидазой выделены три группы медиаторов с разным
рП-оптимумом [Wilson and Turner, 1992]:

■ рН-оптимум 5,6 (цитратный буфер) — хиноны и кислород;

■ рН-оптимум 7,5 (фосфатный буфер) — диамины, ферроцены и
TTF-TCNQ;

■ рН-оптимум < 4 — [Fe (CN₆)]³ и йодфенолы.