Автореферат (Изменения цитоархитектоники, метаболической активности нейронов и экспрессии эстрогеновых рецепторов в ядрах гипоталамуса и передне-базального комплекса мозга человека при старении, болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии), страница 7

Однако, учитывая данные литературы об отсутствииотчётливых положительных эффектов от терапии эстрогенами при БоАл внескольких клинических исследованиях (Sherwin, 2003; Brinton, 2004),следующим этапом работы стало исследование мРНК ЭР у пациентов сБоАл на предмет сплайсинговых вариантов, которые могли бы объяснитьпримечательное увеличение ядерных ЭР и, возможно, негативныерезультаты лечения эстрогенами.

Указанные исследования проведены вММЯ,вкоторомобнаруженоповышениеиммуноцитохимическойэкспрессии ядерных ЭР при БоАл, и которое может быть легко изолированоиз замороженной ткани мозга, требуемой для применения ЦПР.Экспрессия классической мРНК ЭРα была значительно повышена приБоАл, что подтверждает предыдущие результаты, свидетельствующие об33увеличении иммунореактивности ядерных ЭРα в ММЯ случаев с БоАл.Увеличение экспрессии белка и мРНК ЭРα в ММЯ при БоАл можнообъяснитьотрицательнойобратнойсвязьювусловияхнедостаткациркулирующих в плазме и локально синтезирующихся в ММЯ эстрогеновпри БоАл. Относительно высокий уровень экспрессии классической мРНКЭРα, а также повышение иммунореактивности ядерных ЭРα при БоАлуказывают на возможность благоприятного воздействия эстрогенов напознавательные функции, ассоциированные с ММЯ, при БоАл.

К нимотносятся память на недавние события, обучение, эмоции, ориентировка впространстве и обидчивость (Swaab, 2003).С другой стороны, в ММЯ обнаружено значительное количествосплайсинговых вариантов с повреждениями различных функциональныхдоменов ЭРα (э7, э4 и э2 и MB1). Изоформа э7 является основнымсплайсинговым вариантом мРНК ЭР в ММЯ пациентов с БоАл иконтрольных случаев. Для неё характерен высокий уровень экспрессии,близкий или даже превышающий содержание классической мРНК ЭР.Утрата седьмого экзона в э7 подразумевает потерю значительной частидоменадлясвязываниясгормонамиилиганд-зависимойтрансактивационной функцией AF2, что приводит к невозможностисвязывания с лигандами, нечувствительности варианта э7 к эстрогенам ианти-эстрогенам и отсутствию ассоциации с ко-активаторами (Garcia-Pedreroet al., 2003).

Помимо этого для этой изоформы характерно нарушениераспознавания эстроген чувствительных элементов и дефект связывания сДНК. Более того, э7 известен в качестве доминантного негативногосплайсингового варианта, ингибирующего связывание ЭР и ЭР с ихчувствительными элементами, а, следовательно, и эстроген-зависимуютранскрипционнуюактивациюпосредствомобоихклассическихэстрогеновых рецепторов (Garcia-Pedrero et al., 2003). Статистическидостоверных различий в содержании сплайсинговых вариантов э7, э4 и34э2 между пациентами с БоАл и контрольными случаями установлено небыло. Однако, пропорциональное соотношение изоформы э7 к мРНК ЭРбыло выше у пожилых контрольных случаях, чем в группе с БоАл (p = 0.037).Экспрессия классической мРНК ЭР, а также сплайсинговых вариантов э7и э2 уменьшалась с возрастом в ММЯ контрольных и случаев с БоАл, чтоуказывает на возможное генерализованное снижение уровня транскрипции упожилых людей.

Относительно более низкий уровень экспрессии изоформыэ7 у пациентов с БоАл свидетельствует об уменьшении эффективностиальтернативного сплайсинга при БоАл.В настоящей работе удалось впервые выделить из ММЯ случая с БоАлтранскрипт из 800 азотистых оснований с исключением 168 нуклеотидов изпервого экзона, комплементарных последовательности между нуклеотидами573 и 741 мРНК ЭР человека (GenBank AY750962). Утраченнаяпоследовательность соответствует экзонному интрону типа U2 согласнономенклатуре Sharp и Burge (1997). Очевидно, что классическая мРНК ЭРсохраняет этот интрон. Основываясь на работах с удалением различныхфрагментов домена A/B ЭР в фибробластах куриных эмбрионов идрожжевых моделях (Metzger et al., 1995), уместно предположить, чтообразующийсябелокбудетхарактеризоватьсяснижениемтрансактивационной функции 1 приблизительно в 4 раза.

С помощьюполиклональных антител, распознающих специфичный сплайсинговый сайтнового варианта, значительное количество нейронов с МВ1 обнаружено вядрах моста, дорсальном двигательном ядре блуждающего нерва впродолговатом мозге, двигательных ядрах передних рогов спинного мозга итуберомамиллярном ядре гипоталамуса.

В связи с этим последующаяколичественная оценка изменений интенсивности окрашивания МВ1 вразличных возрастных группах и при БоАл осуществлялась именно вгистаминэргическом ТМЯ. В качестве параметра, отражающего уровеньэкспрессии МВ1 на уровне белка, использовалось определение удельной35доли профильной площади нейронов ТМЯ, занятой иммунореактивным МВ1.Средний процент профильной площади нейронов ТМЯ, занятой МВ1,увеличивался с возрастом у женщин (r = 0.640; p = 0.002) и не изменялся пристарении у мужчин (r = -0.133; p = 0.556). После разделения группы женщинс учётом среднестатистического возраста наступления менопаузы оказалось,что иммуноцитохимическая экспрессия МВ1 выше у женщин послеменопаузы (10 случаев в возрасте 58-94 лет), чем у молодых женщин (7случаев в возрасте 21-46 лет) (p = 0.008).Таким образом, значительная часть эстрогеновых рецепторов  в ММЯпожилых людей не связывается с эстрогенами и не активизируеттранскрипцию через эстроген чувствительные элементы, что объясняетотсутствие эффектов при назначении эстрогенов пожилым женщинам ипациенткам с БоАл.Исследование специфичности и возможных причинувеличения ядерных ЭР при БоАлЧтобы ответить на вопрос о специфичности феномена увеличенияэкспрессииядерногоЭРдляБоАл,мыпровелисравнительноеиммуноцитохимическое исследование ЭР в ядрах гипоталамуса и переднебазального мозга при болезни Альцгеймера, сосудистом слабоумии (СС) и вконтрольных случаях.

Статистически значимых различий в интенсивностиокраски ядерных ЭР между контрольными и случаями с СС в изучаемыхядрах обнаружено не было. Достоверность увеличения интенсивностиокраски ядерных ЭР при БоАл была подтверждена в ВЯДБ, БЯМ, СОЯ иММЯ. Более выраженным это увеличение оказалось в группе мужчин сБоАл. При этом статистически значимых различий в интенсивности окраскиЭР между случаями с СС и БоАл обнаружено не было за исключениемБЯМ, в котором сравниваемый показатель (интенсивность окрашиванияядерных ЭР) оказался выше в группе с БоАл (p = 0.020), чем при СС.36ПосравнениюсконтрольнымислучаямивгруппесССиммунореактивность ароматазы, индикатора локального синтеза эстрогенов,в нейронах была значительно повышена в БЯМ (p = 0.006) и снижена в СОЯ(p = 0.001).

Следует отметить, что в обоих ядрах различия были болеевыражены у мужчин (p = 0.016), что соответствует эпидемиологическимданным о более высокой частоте встречаемости у них СС (Sachdev et al.,1999). В группе с СС иммунореактивность ароматазы в нейронахувеличивалась с возрастом в БЯМ (r = 0.633; p = 0.036). В большинствеслучаев характер изменений ароматазы при СС и БоАл совпадал.Таким образом, при сосудистом слабоумии значительных измененийЭР в ядрах гипоталамуса и передне-базального мозга не наблюдается.Однако, стоит отметить высокую вариабельность данных, а такжевозможность изменения ЭР в зонах ишемических или геморрагическихинфарктов при СС. Более того, было продемонстрировано, что экспрессияядерных ЭР более значительно увеличена при БоАл, чем при СС.Увеличение экспрессии ядерных ЭР скорее специфично для БоАл, нозакономерной связи с нейропатологическими проявлениями БоАл не имеет.Принимая во внимание тот факт, что в большинстве случаев главнымэндокринным регулятором ЭР является его лиганд 17-эстрадиол, которыйвызывает снижение как белка, так и мРНК ЭР по авторегуляторнойобратной связи(Alarid et al., 1999), мы изучили вероятность того, чтоувеличение ядерных ЭР при БоАл обусловлено изменениями уровняэстрогенов.

Концентрация эстрогенов в плазме людей старше 50 летснижена. Именно этой возрастной группе (56-94 лет) принадлежат изучаемыеслучаи с БоАл и СС. В то же время, уровни эстрогенов в плазме при БоАл неизменяются. Даже если бы подобные различия и имели место, они всё равноне объяснили бы сложные специфичные для ядер изменения ЭР при БоАл(увеличение в ВЯДБ, БЯМ, ИНФ, ММЯ и СОЯ, уменьшение в гиппокампе, и37отсутствие изменений в ТМЯ).

Поэтому, мы предположили возможностьнарушения местного синтеза эстрогенов.Чтобы ответить на этот вопрос, мы исследовали экспрессию ароматазы,ключевого фермента в биосинтезе эстрогенов. Тогда как в БЯМ при БоАлуровень ароматазы увеличен, в большинстве гипоталамических ядер,например в СОЯ, ИНФ и ММЯ он уменьшен, а в ВЯДБ и ТМЯ не изменён,несмотря на довольно высокий уровень экспрессии в последних.

Повышениеэкспрессии ароматазы в БЯМ и вероятно высокий уровень локальносинтезирующихся эстрогенов в этом ядре могут объяснить увеличение здесьЭР при БоАл пара/интра/аутокринной регуляцией. Действительно, в 9случаях с БоАл выявлено выраженное увеличение как ядерных ЭР, так иароматазывнейронахБЯМ.Болеетого,интенсивностьиммуноцитохимического окрашивания ядерных ЭР и ароматазы быласогласованно повышена в ВЯДБ у 8 случаев с БоАл.

Однако, вгипоталамических СОЯ, ИНФ и ММЯ при БоАл обнаружена обратнаязависимость между ЭР и ароматазой. Очевидно, что в этой области мозгапонижение уровня локально синтезированных эстрогенов (оцениваемыхкосвенно по иммунореактивности ароматазы) и эстрогенов плазмы приводитк увеличению экспрессии ядерных ЭР по механизму положительнойобратной связи.

При СС экспрессия ЭР не увеличивается, а измененияароматазы идентичны таковым при БоАл. Таким образом, полученныеданные предполагают отсутствие закономерной связи между ЭР иароматазой в мозге и указывают на то, что изменения локального уровняэстрогеновнеявляютсяисключительнымобъяснениемповышенияиммунореактивности ядерных ЭР при БоАл. Следует учитывать ивозможность того, что ЭР накапливается в ядрах нейронов при БоАлвследствие нарушения деградации в протеасоме.Принимая во внимание, что ЭР - убиквитинированный белок,подвергающийся деградации в протеасоме (Nawaz et al., 1999), мы проверили38гипотезу о том, что увеличение содержания ядерных ЭР при болезниАльцгеймера (БоАл), описанное нами ранее, может быть обусловлено егонарушенным протеолизом в протеасоме. С этой целью, холинэргические ядраот случаев с БоАл, в которых обнаружено значительное повышение ЭР,были окрашены на убиквитин В+1 (УБВ+1).

УБВ+1 - маркер сниженнойактивности протеасомы, характеризующейся неэффективной деградациейаберрантных белков (van Leeuwen et al., 2000). Следует отметить, чтонарушенная убиквитинизация неправильно организованных белков типичнадля мозга при БоАл, и что УБВ+1 был ранее обнаружен в мозге при БоАл(Van Leeuwen et al., 2000).Иммунореактивный УБВ+1 выявлялся в виде компактных телецокруглой формы, напоминающих нейрофибриллярные клубки. Наиболееинтенсивным окрашивание УБВ+1 оказалось в БЯМ и ТМЯ при БоАл.Значительно меньшее количество нейронов, экспрессирующих УБВ+1, былообнаружено в ВЯДБ и ММЯ, где характер окрашивания был болеедиффузным, с преимущественной локализацией в цитоплазме.