Не полностью решённые вопросы

1. Применение методов адсорбционной спектроскопии для исследования биологическихобъектов в ультрафиолетовой и видимой области.Адсорбция— увеличение концентрации растворенного вещества у поверхности раздела двухфаз (твердая фаза-жидкость, конденсированная фаза - газ) вследствиенескомпенсированности сил межмолекулярного взаимодействия на разделе фаз3. Флуоресцентные методы исследования фотосинтетических процессов.4. ЭПР-спектроскопия в исследовании биологических мембран.Электронный парамагнитный резонанс - это явление резкого возрастания поглощения энергииэлектромагнитной волны системой парамагнитных частиц (электронов с некомпенсированными спинами),помещенных во внешнее магнитное поле, при резонансной частоте волны.Далее идет теория этого метода //Известно, что в постоянном магнитном поле напряженности Но спины электронов будуториентироваться вдоль поля.

Энергетический уровень электрона со спином s= 1/2 расщепляется надва уровня в соответствии с параллельным и антипараллельным полю Но направлением спина:Разность энергетических уровней составляет:-магнетрон БораПри общем числе спинов в системе N отношение заселенностей спинов на нижнем (N1) и верхнем(N2) уровнях определяется разностью энергий по закону Больцмана:,где N1+N2=N, N1>N2Наложим теперь на образец помимо постоянного Но и переменное магнитное поле с частотой v,перпендикулярное постоянному полю. Тогда в системе будут индуцироваться вынужденныепереходы между уровнями с вероятностью, одинаковой для переходов N1 —- N2 и N2 —> N1. Таккак исходно N1 > N2, то число переходов в каждый момент времени с нижнего на верхний уровеньN1 —> N2 превысит число обратных переходов N2 —>N1.

При условиипроисходит резонансное поглощение энергии переменного поля. Это явление иназывается электронным парамагнитным резонансом (ЭПР).Сигнал ЭПР обладает не узкой линией, а полосой поглощения с определенной шириной. То есть насамом деле сами энергетические уровни спинового состония обладают определенной шириной Г, т.е несколько размыты.Связь между временем существования данного состояния и шириной Г точного энер.

уровня E0дается соотн. неопределенности:Ширина связана с характером внутримолекулярной динамики в исследуемом образце: Есливязкость мала, то за счет быстрых молекулярныхдвижений взаимные влияния спинов успеваютусредниться при поглощении переменного поля. В этом случае резонанс наблюдается приусредненной линии с уменьш. шириной. Наоборот, замораживание раствора и умен. его вязкостивновь замедлят молекулярные движения. Т.о.

измеряя ширину линии поглощения, можно получитьданные о характере внутримолекулярных движений в микроокружении спиновой частицы(радикал,протон).// теория метода закнченаМетод спиновых меток. Основная идея метода состоит в присоединении к той или инойфункциональной группе белка свободного радикала и изучению характеристик его сигналов ЭПР.Наиболее удобны в этом отношении нитроксильные радикалы, содержащие свободнорадикальнуюгруппу N-O:Неспаренный электрон принадлежит 2р-орбиталям азота и кислорода и фактически делокализованмежду атомами N и О, эффективно взаимодействуя по диполь-дипольному механизму с магнитныммоментом спина ядра атома азота.

В силу этого происходит расщепление линии поглощениясигнала ЭПР (СТС) на три составляющие, соответствующее трем разным проекциям ядерного спинаазота на направление H_0Дальнейшим развитием метода спиновых меток явилась так называемая спектроскопия ЭПР спереносом насыщения, позволяющая исследовать вращения спинметок, связанных смакромолекулами в диапазоне времен корреляции 10~7 с -10~3 с.

Развитие этого методапозволило изучать динамику мембранных белков, белок-белковые и белок-липидныевзаимодействия в биологических мембранах. (!!!)Так с помощью спектроскопии с переносом насыщения была исследована динамика Са-АТФазы вмембранах саркоплазматического ретикулума и протеолипосомах, что позволило выявить связьконформационной подвижности белка с его АТФазной активностью, показать, чтовнутримолекулярная подвижность и активность Са-АТФазы зависят от природы ассоциированных сэтим белком липидов.5.

Исследование состояния фотосинтетической электрон-транспортной цепи методом длительногопослесвечения хлорофилла.При интенсивном облучении растения имеет место фотохим тушение.В ФС1 есть набор в-в, которые вз-уютпо донорно-акцепторному механизму. Антенна возбуждается фотоном, происходит миграция энергии. Приинтенсивном облучении антенне похуй, дошел ли электрон до конца ФС, поступают еще электроны, можетнаступить пиздец.

По интенсивности излучения определяют время релаксации. Меняя параметры можновлиять на выход флуоресценции, кпд процесса. В конечном итоге мы либо ингибируем процесс(ФС несправляется), либо варьирум его.6. Методы исследования электрических свойств бислойных липидных мембран и липосом.Липосомы, или фосфолипидные везикулы (пузырьки), получают обычно при набухании сухихфосфолипидов в воде илипри впрыскивании раствора липидов в воду.

При этом происходит самосборкабимолекулярной липидной мембраны. Минимуму энергии Гиббса отвечает замкнутая сферическаяодноламеллярная форма мембраны. При этом все неполярныегидрофобные хвосты находятся внутримембраны и ни один изних не соприкасается с полярными молекулами воды. Однако чаще получаютсянесферическиемноголамеллярныелипосомы, состоящие из нескольких бимолекулярных слоев, многослойные липосомы.Отдельные бимолекулярные слои многослойной липосомыотделены воднойсредой.

Толщина липидных слоев составляет, в зависимости от природы липидов, 6,5 - 7,5 нм, арасстояние между ними - 1,5 - 2 нм. Диаметр многослойных липосомколеблется в пределах от 60 нм до400 нм и более. Однослойные липосомы можно получить различными методами, например из суспензиимногослойных липосом, если обработать их ультразвуком. Диаметр однослойных липосом, полученныхэтим методом, составляет 25 - 30 нм. Разработаны и другие методы получения однослойных липосом, втомчисле диаметром до 400 нм и более.Липосомы представляют собой в некотором роде прообразклетки.Они служат моделью дляисследований различныхсвойств клеточных мембран.Клетка или липосома, несущие на поверхности электрический заряд, движутся в постоянномэлектрическом поле с постоянной скоростью.

В переменном электрическом поле возникает т.н.диэлектрофорез. Каждая клетка обретает определённый электрический момент, в результате чего онивыстраиваются по силовым линиям поля, притягиваются друг к другу и втягиваются в областьмаксимального поля. При увеличении напряжённости клетки деформируются, а затем, в области полюсовпроисходит явление электропорации. Оно было досконально изучено на плоских бислойных липидныхмембранах (БЛМ).

Время жизни БЛМ зависит от амплитуды приложенной разности потнциалов илипидного состава. Для создания потенциала на мембранах фосфолипидных везикул к суспензии липосомв незабуференном растворе сахарозы добавляли ацетат калия. Уксусная кислота в недиссоциированнойформе проникает внутрь липосом, создавая на мембране разность концентраций ионов водорода (DpH).Эта разность концентраций препятствует дальнейшему вхождению ацетата, и липосомы сжимаются подвлияние осмотического давления K+ и Ac– снаружи.

Судить о таком сморщивании липосом можно повозрастанию светорассеяния (и уменьшению светопропускания) суспензии, как это видно на рис.9. Онаступлении пробоя можно судить по резкому скачку светопропускания суспензии (DT на рис.9), которыйсвязан с входом ацетата калия в липосому. Если отложить величину этого скачка светопропускания какфункцию потенциала на мембране, рассчитанного по уравнению Нернста, то мы увидим отчетливыйперелом на кривой, который соответствует потенциалу пробоя (см. рис.10).БЛМ:Для изучения ионной проницаемости липидного слоя мембран используют БЛМ. Для приготовленияБЛМ (см.

рис. 8. 19) в стаканчик с раствором электролита помещаютвторой, тефлоновый стаканчик , встенкекоторогосделано отверстие, диаметром около 1 мм.С помощьюкапилляра вотверстиевводятмаленькую каплю раствора фосфолипида вжидком углеводороде, гептане или гексане(рис. 8.20, А). Молекулы фосфолипидовсобираются на поверхности капли такимобразом, что полярныеголовки молекулобращены в водную среду, а гидрофобныехвосты – внутрькапли (рис. 8.21, Б).Постепеннорастворительуходитизкапли и улетучивается, а капля превращается влипидную пленку (БЛМ),рис. рис. 8.20, В, Г). В БЛМ полярные головки фосфолипидовобращены в водную фазу, анеполярныеуглеводородные цепи жирных кислот сливаются в сплошную вязкую фазу во внутреннейчастилипидной мембраны.