1631210426-ee3ce1e36ee952a373648baec5c039da (Лекция 17 - Модификация остатков ароматических аминокислот)

ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ И ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВОбратите внимание! Необходимо выполнять домашнее задание!Вопросы задаются в слайдах презентации. Они помечены краснымжирным шрифтом. Предложенные задания в презентации сдать до 1мартаКому недостаточно материала презентации, загляните на стр. учебника Д.Г.Кнорре, Т.С. Годовикова. С.Д. Мызина, О.С.

Федорова «Биоорганическаяхимия». Учебник: Северин «Биохимия».ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ И ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ.Окислительно-восстановительные реакции.Введение карбоксилатных анионных групп по боковому радикалу глутамата: роль витамина К в процессе карбоксилирования.Мембранный каталитический комплекс активации протромбина. Роль посттрансляционной модификации прифункционировании систем свертывания крови и фибринолизе. Д-димер и коронавирус. Разработка молекулярных инструментовдля исследования формирования тромба in vivo в модели тромбоза, индуцированного лазером.Посттрансляционная и химическая модификация остатков ароматических аминокислот.

Реакции электрофильного замещения.Окислительное галогенирование остатков тирозина и триптофана. Модификация остатков тирозина при синтезе йодтиронинов.Фрагментация полипептидной цепи по остаткам тирозина и триптофана.Химическая модификация аминокислотных остатков в белках для аналитического применения. Введение метки по остаткамтирозина (введение радиоактивных изотопов йода).Модификация имидазольного остатка в гистидине.

Взаимодействие с реагентом Паули (солями диазония).Модификация белков с целью изменения их биологической функции. Взаимодействие белков с диэтилпирокарбонатом.Инактивация РНказы А как следствие модификации остатков гистидина.Полифункциональные реагенты. Выбор мостика, соединяющего реакционноспособные группы бифункционального реагента.Полифункциональные линкеры, содержащие группировки, способные расщепляться под действием химических агентов.Реагенты на аминогруппы.

Реакции с имидоэфирами. Взаимодействие с активированными эфирами (Nгидроксисукцинимидными реагентами, производными пентафторфенола). Реагента на НS-группы белков. Алкилирующиереагенты. Взаимодействие с малеимидами. Дисульфидный обмен.Использование бифункциональных реагентов для создания материалов медицинского назначения.КАРБОКСИЛИРОВАНИЕ ОСТАТКА ГЛУТАМАТА в проферментахпрокоагулянтного пути свертывания кровиПротромбин – белок, состоящий из 582 аминокислотных остатков; егопротеолитическое расщепление по связям Arg–Thr (274–275) и Arg–Ile(323–324) приводит к удалению большого N-концевого фрагмента иобразованию тромбина, состоящего из соединенных дисульфидной связьюцепей А и В.

Дефектный протромбин, образующийся в печени вотсутствие витамина К, не способен связывать ионы кальция,необходимыедляпоследующегосвязыванияпротромбинасфосфолипидами и активации его путем превращения в тромбин.Показаны активный сайт и части молекулы, ответственныеза связывание тромбина с субстратами и кофакторами. (Активныйсайт — часть молекулы, непосредственно распознающее месторасщепления и осуществляющее ферментативный катализ.)Выступающиечастимолекулы(экзосайты)позволяютосуществлять «переключение» молекулы тромбина, делая егомультифункциональным белком, способным работать в разныхрежимах.

Например, связывание тромбомодулина с экзосайтом Iфизически перекрывает доступ к тромбину прокоагулянтнымсубстратам (фибриноген, фактор V) и аллостерически стимулируетактивность по отношению к протеину С.Реакции превращения факторов свертывания в активные формы показаныодносторонними тонкими черными стрелками. При этом фигурные красныестрелки показывают, под действием каких именно ферментов происходитактивация. Реакции потери активности в результате ингибированияпоказаны тонкими зелеными стрелками (для простоты стрелки изображеныкак просто «уход», т.е.

не показано, с какими именно ингибиторамипроисходит связывание). Обратимые реакции формирования комплексовпоказаны двусторонними тонкими черными стрелками.Комплекс исследований гемостаза (Плазминоген,Фибриноген, Фибринолиз,Антитромбин III, D-димер,КАРБОКСИЛИРОВАНИЕ ОСТАТКА ГЛУТАМАТАв проферментах прокоагулянтного пути свертывания кровиМаленькие и относительнонемногочисленные белые клетки —тромбоциты: справа можно видеть, как ониактивируются, меняют формуи прикрепляются к стенке сосуда, формируяагрегат — тромб.Система свертывания кровиГлавное звено в свертывании крови – превращение растворимогобелка фибриногена под действием тромбина в фибрин-мономер, азатем путем полимеризации последнего – в нерастворимыйфибрин-полимер. Фибриноген – высокомолекулярный белок,состоящий из трех пар неидентичных субъединиц - А, В и .

Врезультате протеолиза (расщепляются пептидные связи междуостатками Arg и Gly) от фибриногена отщепляются 4фибринопептида: два А-пептида от двух А-цепей и два Впептида от двух В-цепей.Ala-Asp-Ser*-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-ValArg (пептид А)Val-Asp-Pro-Gly-Glu-Ser-Thr-Phe-Ile-Asp-Glu-Gly-Ala-Thr-Gly-Arg(пептид В)Отщепление фибринопептидов, обладающих большим числомостатков полярных аминокислот, а также заряженнымигруппировками О-фосфосерина (Ser*, у человека) резко изменяетсвойства цепей и способствует агрегации мономеров в фибринполимер. Сгусток крови, образовавшийся при спонтаннойполимеризации мономеров фибрина, вначале является рыхлым инестойким. Затем он стабилизируется за счет поперечныхковалентных «сшивок» между антипараллельными -цепями, вчастности путем реакции трансамидирования с участиемостатков Gln и Lys.Реакция трансамидирования, катализируемаятрансглутаминазойСистема свертывания кровиФибриноген – единственный субстрат, из которого поддействием тромбина создается волокнистая сеть фибрина –материальная основа сгустка крови.

Основа молекулыфибриногена составлена из трех пар зеркальнорасположенных полипептидных цепей α, β, γ. В центремолекулы можно видеть области связывания, которыестановятся доступными при отрезании тромбиномфибринопептидов А и Б (FPA и FPB на рисунке). Б. Механизмсборки фибринового волокна: молекулы крепятся другк другу «внахлест» по принципу головка-к-серединке, образуядвухцепочечное волокно.

В. Электронная микрофотографиягеля: фибриновые волокна могут склеиватьсяи расщепляться, образуя сложную трехмерную структуру.Остановка кровотечения основана на той же идее, чтоиспользуют домохозяйки для приготовления холодца, желе —превращении жидкости в гель (коллоидную систему, гдеформируется сеть молекул, способная удержать в своихячейках тысячекратно превосходящую ее по весу жидкостьза счет водородных связей с молекулами воды).Система свертывания представляет собой каскад —последовательность реакций, где продукт каждой реакциивыступает катализатором следующей.

Результатом работыкаскада является белок фибрин, способный полимеризоватьсяи образовывать сгусток (гель). Подавляющее большинствореакций активации — это реакции протеолиза, т.е. частичногорасщепления белка, увеличивающего его активность. Почтикаждый фактор свертывания обязательно тем или инымобразом ингибируется: обратная связь необходима длястабильной работы системы.Белки свертывания обозначены либо названиями, либоримскими цифрами, либо аббревиатурами (TF — тканевыйфактор, PC — протеин С, APC — активированный протеин С).Необходимо сдать кровь на «Комплекс исследований гемостаза»(Плазминоген, Фибриноген, Фибринолиз, Антитромбин III, Dдимер и др.

показатели).D-димер является наиболее специфичным маркеромдеградации фибриновых сгустков любойлокализации, проще говоря, маркером интенсивностии характера процессов тромбообразования.Увеличение концентрации D-димера четко иоднозначно свидетельствует об активациифибринолиза, чему в свою очередь, обязательнопредшествует избыточное образованиенерастворимого фибрина, т.е. тромба.

Повышениесодержания D-димера в плазме кровисвидетельствует об активации процессовсвертывания крови в результате повреждения тканейили развития вызывающих тромботическиеосложнения заболеваний.На данный момент времени переходят от вопроса «Как устроено свертывание?» к вопросам «Почему свертываниеустроено именно так?», «Как оно работает?» и, наконец, «Как нам нужно воздействовать на свертывание, чтобыдобиться желаемого эффекта?». Первое, что необходимо сделать для ответа — научиться исследовать свертываниецеликом, а не только отдельные реакцииКак помогают биоорганики в получении ответов на данные вопросы? Путем химической модификации они могут,например, ввести флуоресцентную метку в антитела.

Предложите схему модификации белка реагентами, содержащимифлуоресцентную метку. Слайд 13, взятый из предыдущей лекции, возможно, поможет вам ответить на данный вопросФормирование тромба in vivo в модели тромбоза,индуцированного лазером. Эта картинка воспроизведенаиз исторической работы, где ученые впервые смоглипронаблюдать развитие тромба «вживую». Для этогов кровь мыши впрыснули концентрат флуоресцентномеченных антител к белкам свертывания и тромбоцитам, и,поместив животное под объектив конфокальногомикроскопа (позволяющего осуществлять трехмерноесканирование), выбрали доступную для оптическогонаблюдения артериолу под кожей и повредили эндотелийлазером. Антитела начали присоединяться к растущемутромбу, сделав возможным его наблюдение.General chemoenzymatic strategy for drug conjugation to the conserved glycan of mAbs for the construction of homogenous ADCs.

The strategyconsists of glycan remodelling that allows the incorporation of non-natural azide-tagged carbohydrate motif (GalNAc 94 or Sia 93 ) followed bySPAAC ligation with a suitable payload. Общая химиоферментная стратегия конъюгации лекарственного средства с консервативнымгликаном mAb для создания гомогенных ADC. Стратегия состоит в ремоделировании гликанов, которое позволяет включать неприродныйазид-меченый углеводный мотив (GalNAc 94 или Sia 93) с последующим лигированием SPAAC с подходящей полезной нагрузкой.ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ И ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ.РЕАКЦИИ АРОМАТИЧЕСКОГО ЭЛЕКТРОФИЛЬНОГО ЗАМЕЩЕНИЯПосттрансляционная модификация белка, включающаястадию йодирования приводит к образованию тироидныхгормонов щитовидной железы (йодтиронины): 3,3’,5трийодтиронину (трийодтиронин, Т3) и 3,3’,5,5’тетрайодтиронину (тироксин, Т4).В крови йодтиронины находятся в связанной форме вкомплексе с тироксинсвязывающим белком.

Только 0,03 %Т4 и 0,3 % Т3 находятся в свободном состоянии.Биологическая активность йодтиронинов обусловленанесвязанной фракцией. Транспортные белки служатсвоеобразным депо, которое может обеспечитьдополнительное количество свободных гормонов.Йодтиронины участвуют в регуляции многих процессовметаболизма, развития, клеточной дифференцировки, врегуляции экспрессии генов.Синтез тироидных гормоновЙодтиронины синтезируются в составе белкатиреоглобулина.Тироглобулин – гликопротеин с молекулярноймассой 660 кДа, содержит 115 остатковтирозина, синтезируется в базальной частиклетки и хранится во внеклеточном коллоиде втироидных фолликулах.Тиреоглобулин синтезируется на рибосомахшероховатого эндоплазматического ретикулумав виде претиреоглобулина, затем переносится вцистерны эндоплазматического ретикулума, гдепроисходитформированиевторичнойитретичной структуры, включая процессыгликозилирования.

Из цистерн тиреоглобулинпоступает в аппарат Гольджи, включается всостав секреторных гранул и секретируется вовнеклеточныйколлоид,гдепроисходитйодирование остатков тирозина и образованиейодтиронинов.Под действием тиропероксидазы окисленныййод реагирует с остатками тирозина собразованием монойодтиронинов (МИТ) идийодтиронинов (ДИТ).Две молекулы ДИТ конденсируются собразованием тироксина (Т4 ), а МИТ и ДИТ собразованием трийодтиронина (Т3 ).Йодтиреоглобулин транспортируется в клеткупутем эндоцитоза и гидролизуется ферментамилизосом с освобождением тироксина и 3,3’,5трийодтиронина.Аутоиммунный тиреоидит и другие заболевания, связанные с функцией щитовидной железыЙодтиронины регулируют рост и дифференцировкутканей и энергетический обмен.