15 Молекулярный механизм кроссинговера (Лекции по генетике)

Лекция 15МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ КРОССИНГОВЕРА«Генетика», ФЕН и МФ НГУ, бакалавриат, 3 курс ноябрь 2014 г.Костерин О.Э., kosterin@bionet.nsc.ru15.1. Вводные замечания.Данный вопрос представляется мне наиболее сложным во всей первой части курсагенетики. В этом деле очень мало помогают существующие учебники. В учебнике И.Ф.Жимулева 2003 г. издания совместно рассматриваются эукариоты и прокариты, а такжепроцессы in vivo на in vitro, притом что рекомбинация в этих случаях может происходитьпо разному, а иллюстрации сопровождаются минимумом текста. Хочу оговориться, чтонас сейчас интересует механизм мейотического кроссинговера как процесса, общего иединообразного для всех эукариот, но не свойственного прокариотам.

В свежем учебникеС.Г. Инге-Вечтомова подробно рассмотрена устаревшая модель Р. Холлидея, основаннаяна однонитевых разрывах, а совеременная модель, основанная на двунитевых разрывах,упомянута лишь следующим образом: «В инициации мейотического кросинговера играютроль не только однонитевые разрывы, но и (а возможно и в большей степени) двунитевыеразрывы ДНК» (с. 202). Лучше всего данный вопрос освещен в недавней книге И.Ф.Жимулева и Д.Е. Корякова «Хромосомы: структура и функция», однако его обсуждениеприведено в странном месте – в подразделе «Синаптонемный комплекс» - притом, чтосинаптонемный комплекс лишь косвенным образом участвует в механизме кроссинговера- и оборвано на полуслове перед самым сложным моментом – разрешением структурХоллидея.

(Кроме того, дело там представлено так, как если бы сестринский обмен былравновероятен с гомологическим, хотя это и не сказано в явной форме, а на рисунке,иллюстрирущей механизм, не показаны гетеродуплексные участки.)Для правильного понимания всего того, о чем будет говориться ниже, нужно всевремя держать в голове, что в кроссинговере участвуют две хромосомы, которые в суммеимеют четыре хроматиды и восемь цепей ДНК. В каждом акте кроссинговера участвуютдве хромосомы, две хроматиды и четыре цепи ДНК. Ниже у вас возникнет многособлазнов перепутать цепи ДНК и двухцепочечные молекулы ДНК (хроматиды) иперекрест между вторыми – с перекрестом между первыми. Следует бытьвнимательными, чтобы этого не сделать.

С той же целью – чтобы не запутаться - мы небудем отвлекаться на исторические представления о механизме кроссинговера, ещенедавно господствовавшие, но оказавшиеся неверными.115.2. Механизм кроссинговераРассмотрев митотический кроссинговер и сестринский хроматидный обмен, мыпришли к выводу, что эти явления, по всей видимости, являются всего лишь побочнымипродуктами репарации двунитевых разрывов (причем сами эти разрывы могут быть неслучайными дефектами, а вноситься специально для облегчения рассоединениясестринских хроматид после репликации ДНК). Также мы имели возможность убедиться всходстве митотического и мейотического кроссинговера, как по результату, так и понетривиальной U-образной зависимости от температуры. Это дает нам основаниепредположить, что и в механизме мейотического кроссинговера у эукариот задействованыэлементы механизма, связанного с залечиванием двойных разрывов.Немаловажно, что если однонитевой разрыв ДНК может быть залечен по матрицевторой, целой цепи, то двунитевой разрыв может быть залечен либо сразу же в моментсвоего возникновения, когда концы ДНК еще находятся рядом, либо только по матрицеидентичной или гомологичной хромосомы.

Поэтому репарация двунитевых разрывовдолжна включать в себя механизмы поиска таких гомологов. Неудивительно, что этасистема как раз очень пригодилась в мейозе, в профазе которого совершенно необходимообеспечить гомологическое выравнивание гомологичных хромосом в целях ихдальнейшего разделения.Кроссинговер становится возможен только после того, как обеспечено спариваниеи выравнивание гомологов. По образному выражению П.М.

Бородина, первым этапомспаривания гомологов является грубое выравнивание «по штрихкоду» - друг друга«узнают» участки ДНК, имеющие сходный тип хроматина, то есть набор белковхроматина, который, в конечном счете, так или иначе определяется первичной структуройДНК. К таким участкам прежде всего относятся прителомерные и приценромерныерайоны, блоки гетерохроматина, но существует и более дробное разделение хроматина побелковому составу (разным его типам условно приписан «цвет» - зеленый, черный и пр.).Вслед за этим наступает тонкое выравнивание по гомологии ДНК, которое обычнозавершается образованием синаптонемного комплекса. Механизм выравнивания погомологии ДНК заслуживает особого внимания. Начало его выглядит совершенно поварварски.

На стадии лептотены белок Spo11, гомологичный топоизомеразеархеобактерий, вносит в ДНК множественные двунитевые разрывы. Примерно 300разрывов на хромосому у мыши, несколько тысяч – у лилии.2Затем с разрывами связывается белок RAD51 и расплетает ДНК на определеннуюдлину (Рис. 15.1). У дрожжей функции RAD51 препятствует та самая «антирекомбиназа» белок SRS2, мутанты по которому имеют повышенную интенсивность кроссинговера иболее чувствительны к мутагенам. По всей видимости, гомологичные или аналогичныебелки существуют и у других эукариот. Далее происходит нечто вроде «зачисткиконтактов» - разрыв расширяется с каждой стороны путем разрушения той цепи ДНК,которая в этом месте имеет 5’-конец, так что на некоторую дистанцию от разрыва ДНКоказывается одноцепочечной и оканчивается 3’-концом.

Один из таких одноцепочечныхконцов связывается с белками RAD51 и RAD54, другой – с белком DMC1.Рисунок 15.1. Начальные стадии кроссинговера на уровне ДНК – двунитевой разрыв,«зачистка концов», миграция ветви и образование D-петли (по Жимулев И.Ф., Коряков.2009. Хромосомы. Структура и функции. Новосибирск: Изд-во СО РАН, с изм.).Одноцепочечный конец ДНК, связанный с этим последним, делается активным иначинает блуждать, пока не обнаружит двойную цепь ДНК, содержащуюкомплементарный себе участок.

При этом он способен вытеснять из двойной цепи ДНКучасток, гомологичный себе, и вместо него сам образовывать дуплекс с участком,комплементарным им обоим. Тем самым он осуществляет инвазию; принято говорить об3инвазии конца одиночной нити (single end invasion). Все это показано на упрощеннойсхеме Рисунка 15.1.Вслед за инвазивным концом, в новую двойную спираль-акцептор вовлекаетсягораздо большая длина инвазивной нити ДНК, при этом двойная спираль-доноррасплетается. Этот процесс назвается миграцией ветви (branch migration) Вытесненный издвойной спирали-акцептора одноцепочечный участок ДНК образует так называемую Dпетлю (D-loop), которая находит одноцепочечный участок ДНК-донора и образует с нимдуплекс.

При миграции ветви D-петля также расширяется и оба дуплекса, образованныецепями ДНК от разных хроматид, удлиняются. (Давайте в дальнейшем для простотыназывать дуплексы, образованные цепями ДНК от разных хроматид «гетеродуплексами»,хотя первичная структура обеих хроматид может быть и идентичной). Миграция ветви,образование D-петли и расширение гетеродуплексов распространяется и по другуюсторону от точки инициации обмена (точки инвазии, соответствующей точкепервоначального двуцепочечного разрыва), так что D-петля оказывается приблизительносимметричной относительно этой точки.В результате мы получаем два ДНК-дуплекса, образованных цепями ДНК от двухразных хроматид. Однако эти дуплексы имеют однонитевые бреши, соответствующиеучасткам первоначального расширения двунитевого разрыва («зачистки концов»). В этомместе вторая цепь ДНК достраивается по матрице имеющейся.

В точке, гдеодноцепочечный участок на ДНК-доноре кончается (слева на наших схемах), вновьсинтезируемая цепь сшивается с 5-концом второй цепи ДНК-донора, и у нас получаетсясимметричная с точки зрения цепей ДНК промежуточная структура: участок, где дваДНК дуплекса образованы цепями от разных хроматид, отграниченный с каждой стороныместами, где обе «чужие» цепи, перекрещиваясь, возвращаются в свои хроматиды. Такойперекрест цепей ДНК от разных дуплексов называется структурой Холлидея (Hollidaystructure) или полухиазмой, так что промежуточная структура ограничена с каждойстороны такой структурой Холлидея и иногда сама называется двойной структуройХоллидея (double Holliday structure).Р.

Холлидей предложил данную структуру в 1964 г. в рамках своей моделимеханизма кроссинговера, основанной на однонитевых разрывах ДНК. Модель оказаласьневерной, но структура эта, как видим, действительно образуется, правда всякий раз вдвух экземплярах. Представленная здесь модель механизма кроссинговера былапредложена М.С. Мезельсоном и С.М. Рэддингом в 1975 г.На Рисунке 15.2 показаны два крайних варианта промежуточных структур, оба изкоторых встречаются у сумчатых грибов. Сверху показана промежуточная структура,4характерная для дрожжей. В ней практически отсутствует миграция ветви и расширениеD-петли. Снизу показана промежуточная структура сумчатого гриба Sordaria fimicola, укоторой расширение D-петли распространяется далеко за пределы однонитевых участковвокруг первичного двуцепочечного разрыва (стрелками показаны 3’-концы; длинаучастков ДНК показана не в масштабе – у сордарии промежуточная структура гораздодлиннее, чем у дрожжей, а несимметричная область у них, по-видимому, сравнимыхразмеров.