Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Список сокращение

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1. Системы транспорта калия в митохондриях

1.1.1 Транспорт калия в митохондрии

1. Молекулярные структуры, ответственные за транспорт калия в МХ

1.1.3 Физиологическое значение транспорта калия в МХ

1.1.4 АТФ-ингибируемые калий-транспортирующие каналы

1.2 АТФ-зависимый калиевый канал цитоплазматической мембраны

1.2.1 Структурная организация цитоплазматического АТФ-зависимого калиевого канала

1.3 АТФ-чувствительный калиевый канал внутренней мембраны МХ

1.3.1 Структурная организация митоКАТФ канала

Глава 2. Модуляторы

2.1 Модуляторы митоКАТФ канала

2.1.1 Метаболические модуляторы митоКАТФ канала

2.2 Функциональная роль митоКАТФ

2.2.1 Активация митоКАТФ в развитии устойчивости организма к гипоксии

2.2.2 Механизмы защиты сердца при гипоксии, опосредованные активацией митоКАТФ

2.2.3 Феномен прерывистой гипобарической тренировки

2.3 Выделение МХ

2.3.1 Выделение МХ печени крысы

2.3.2 Выделение МХ сердца крысы

2.3.2 Выделение и очистка митоК_АТФ канала

Глава 3. Изучение энергозависимого входа К+ в МХ методом спектрофотометрии

3.1 Изучение ДНФ-индуцированного выхода ионов калия из МХ

3.2 Получение и очистка антител к белку с молекулярной массой 55 кДа.

3.2.1 Подготовка белка с м.м. 55 кДа: выделение и очистка

3.3 Иммунизация и анализ препарата антител

3.3.1 Детекция специфических антител и определение титра

3.3.2 Вестерн-Блот анализ

3.4 Исследование ДНФ-индуцированного выхода К+ из митохондрий с помощью К+-селективного электрода

3.5 Реконструкция белка в БЛМ

3.6 Иммунноэлектронная микроскопия

3.7 MS-MALDI-TOF/TOF- анализ

3.8 Очистка антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа

3.9 Очистка антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа на колонке с иммобилизованным Белком А

3.10 Ингибиторный анализ с использованием антител к белку

с м.м. 55 кДа

Глава 4. Выделение комплекса цитоплазматических мембран и микросом печени крыс

4.1 Метод отбора высоко- и низкоустойчивых животных

Глава 5. Результаты и обсуждения

5.1 Параметры функционирования митоКАТФ канала у крыс с различной резистентностью, а также у животных, адаптированных к гипоксии

5.1.1 Изучение параметров дыхания и окислительного фосфорилирования в МХ печени и сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии

5.1.2 Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта К+ в МХ печени сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии

5.1.2 Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта К+ в МХ печени сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии

5.2 Изучение структурной организации митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала

5.2.1 Определение гомологии белка с м.м. 55 кДа методом MS-MALDI-TOF/TOF

5.3 Ингибиторный анализ активности митоК_АТФ канала с использованием антител, полученных на белок с м.м. 55 кДа

5.3.1 Определение степени чистоты белка, используемого для иммунизации

5.4 Иммунизация и определение титра полученных антител

5.4.1 Определение специфичности полученных антител

5.4.2 Выделение иммуноглобулинов G (IgG) из антисыворотки и проведение ингибиторного анализа

5.5 Электронная микроскопия МитоК_АТФ канала

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

МитоК_АТФ – митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал

ЦитоК_АТФ – цитоплазматический АТФ-чувствительный калиевый канал

5-ГД – 5-гидроксидекановая кислота

Глиб – глибенкламид

АТФ – аденозин-5’-трифосфат

УТФ – уридин-5’-трифосфат

УДФ – уридин-5’-дифосфат

УМФ – уридин-5’-монофосфат

ГТФ – гуанин-5’-трифосфат

МХ – митохондрии

АТ – антитела

Ф_Н – неорганический фосфат

АФК – активные формы кислорода

KIR – inward rectifying K⁺ channels (канальная субъединица митоК_АТФ канала)

SUR – sulphonyl urea receptor (регуляторная субъединица митоК_АТФ канала,

чувствительная к сульфонилмочевинам)

PCO’s – potassium channel openers (активаторы калиевых каналов)

NFBs – nucleotide phosphate binding domains (нуклеотидсвязывающие участки)

БЛМ – бислойные липидные мембраны

ФИА - феномен ишемической адаптации

ГТ – гипоксическая тренировка

НУ – крысы, низкоустойчивые к гипоксии

ВУ – крысы, высокоусточивые к гипоксии

Введение

Митохондриальный АТФ-ингибируемый калиевый канал (митоК_АТФ), осуществляющий вход калия в МХ, был обнаружен методом пэтч-кламп во внутренней мембране МХ в 1991 г. [Inoue et al., 1991]. Однако, еще в 1981 г. в лаборатории проф. Мироновой был выделен белок с м.м. 55 кДа, обладающий свойствами данного канала. [Миронова и др., 1981]. Позднее было показано, что выделенный белок-канал ингибируется физиологическими концентрациями АТФ [Paucek et al., 1992; Миронова и др., 1996 (I)].

В настоящее время достаточно хорошо исследованы биофизические свойства митохондриального калиевого канала и его физиологическая роль [Миронова и др., 1996 (I, II); Paucek et al., 1992; Inoue et al., 1991; Garlid et al., 1997; Mironova et al., 1999; 2004]. Интерес к исследованию этого канала в последнее время возрос, поскольку было показано, что он, а именно его активация, играет ключевую роль в защите миокарда при ишемии [Grover et al., 1992; Garlid et al., 1997; Vanden Hoek, 2000]. Найден целый ряд синтетических активаторов митоК_АТФ, являющихся потенциальными кардиопротекторами [Gross et al., 1992; Liu et al., 1998; Sato et al., 1998; Tsai et al., 2002]. Недавно в лаборатории проф. Мироновой был обнаружен эффективный природный метаболический активатор митоК_АТФ – уридин-5’-дифосфат (УДФ) [Mironova et al., 2004; Негода А.Е., 2004]. Метаболические активаторы канала имеют ряд преимуществ, по сравнению с их синтетическими аналогами, поскольку их концентрацию в клетке можно регулировать и они не обладают отрицательными побочными эффектами. Действие УДФ, как активатора К⁺-канала, и, следовательно, кардиопротектора, до настоящего времени не было изучено на животных.

Помимо важной роли митоК_АТФ в защите миокарда от ишемических повреждений, некоторые исследователи предполагают участие активации канала в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию [Zhu et al., 2003]. Однако прямые доказательства участия канала в адаптации к гипоксии до настоящего времени не получены, то есть, данный феномен также требует дополнительных исследований.

К настоящему времени нами разработана рабочая модель структуры и регуляции канала, в соответствии с которой митоК_АТФ канал состоит из двух субъединиц – канальной (с молекулярной массой 55 кДа) и регуляторной (с молекулярной массой 63 кДа). Однако вопрос о структуре канала и возможной гомологии с другими белками пока остается открытым. Изучение структуры митоК_АТФ позволит исследовать функцию и регуляцию канала на молекулярном уровне.

В связи с этим, целью данной работы было: изучить структурную организацию митоК_АТФ канала, кардиопротекторное действие УДФ при ишемии миокарда, исследовать параметры функционирования митоК_АТФ у животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию.

Таким образом, в работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать параметры функционирования митоК_АТФ у крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также у животных, адаптированных к недостатку кислорода.

2. Определить гомологию структуры исследуемого белка с м.м. 55 кДа аминокислотным последовательностям известных белков.

3. Получить специфические поликлональные антитела на белок-канал с м.м. 55 кДа, формирующий при встраивании в искусственные мембраны АТФ-ингибируемые К⁺ каналы.

4. Провести ингибиторный анализ АТФ-чувствительного транспорта калия в нативных МХ с использованием полученных антител (АТ) с целью доказательства принадлежности белка с м.м. 55 кДа к системе АТФ-зависимого транспорта К⁺ в МХ.

5. Исследовать иммунолокализацию МитоК_АТФ канала на срезе гепатоцитов и кардиомиоцитах при помощи электронной микроскопии

Глава 1. Обзор литературы

1. Системы транспорта калия в митохондриях

1.1.1 Транспорт калия в митохондрии

Транспорт К⁺ в митохондриях (МХ) имеет большое функциональное значение, так как концентрация К⁺ в цитоплазме значительно превышает концентрацию других катионов, и появление любой неконтролируемой проницаемости митохондриальной мембраны для К⁺ может представлять угрозу осмотической целостности и функциональной интегральности МХ [Brierley et al., 1983]. МХ занимают 40% внутриклеточного пространства в сердечной клетке и до 20% - в клетке печени и по данным [Rottenberg, 1973], в свободном состоянии в матриксе МХ содержится 95 нмоль К⁺/мг белка МХ, в слабосвязанном состоянии – 45 нмоль и в прочносвязанном – 5 нмоль. Концентрация свободного калия в цитоплазме составляет 90-120 нмоль.

Хемиосмотическая теория Митчела включает четыре постулата, последние два из которых имеют отношение к системе транспорта катионов. Согласно этим двум постулатам, внутренняя мембрана МХ: а) непроницаема для Н⁺, ОН^- и всех прочих ионов; б) содержит ряд белков-переносчиков, осуществляющих транспорт неорганических ионов и необходимых метаболитов. Таким образом, по Митчелу, внутренняя мембрана МХ непроницаема для катионов и анионов. Однако из-за большого электрохимического потенциала [Δφ] (~ –200 мВ с матриксной стороны) одновалентные катионы (К⁺ и Na⁺) могут диффундировать через липидный бислой. Проблема такой утечки будет наиболее актуальна для ионов К⁺, как основного катиона цитозоля и матрикса, хотя скорость такой диффузии будет не велика.

Что касается специфических систем транспорта, то было установлено, что в МХ существуют системы: 1) электрогенного входа калия и 2) К⁺/Н⁺-антипортер [Chavez et al., 1977; Diwan, 1981; Garlid, 1980], о существовании которого говорил Митчел [Mitchell and Moyle, 1969].

В работах с использованием радиоактивного калия (⁴²К⁺) было показано, что активный транспорт К⁺ в МХ осуществляется электрогенно и что существует специфическая К⁺-транспортирующая система, функционирующая подобно ионофорам, катализирующим унипорт калия [Gamble, 1957, 1962; Judan et al., 1965; Rottenberg, 1973; Chavez et al., 1977].

В качестве системы электрогенного транспорта К⁺ в МХ предлагались следующие варианты: 1) подвижный переносчик или канал [Jonston and Griddle, 1978; Panov et al., 1980; Jung et al., 1982]; 2) электродиффузное движение через гидрофильные поры и 3) вход калия с участием белковых транспортных систем, которые помимо своей основной функции, могут осуществлять транспорт К⁺ [Brierly, 1980, 1983].

1. Молекулярные структуры, ответственные за транспорт калия в МХ

В настоящее время в литературе в качестве транспортных систем, осуществляющих электрогенный транспорт калия в МХ, рассматриваются следующие структуры: 1) АТФ/АДФ-антипортер или аденинуклеотидтранслоказа (АНТ) [Panov et al., 1980; Le Quoc et al., 1988] и 2) специфические белки, которые образуют во внутренней мембране МХ канал для электрогенного входа ионов калия [Миронова и др., 1981; Diwan et al., 1988; Paucek et a., 1992]. В первом случае предполагается, что АНТ, помимо основных функций, может работать как система электрофоретического транспорта ионов калия в МХ при действии на МХ субмикромолярных концентраций ионов кальция, и как неспецифическая пора для низкомолекулярных соединений при повреждении МХ высокими концентрациями Ca²⁺ [Jung and Brierley, 1981; 1982; Halestrap et al., 1986].

Что касается специфических белков, следует отметить, что в лаборатории Мироновой в 1981 г. методом водно-этанольной экстракции из МХ сердца быка был выделен и очищен белок с м.м. 55 кДа, который при реконструкции в бислойные липидные мембраны (БЛМ) образовывал К⁺-селективные каналы проводимости [Миронова и др., 1981], которые, как было показано позднее, ингибируются физиологической концентрацией АТФ и глибенкламидом, и относятся к семейству АТФ-чувствительных калиевых каналов [Миронова и др., 1996 (I); Mironova et al., 1999]. Структура митохондриального К_АТФ канала не определена [Paucek et al., 1992].

Диван с соавторами, используя детергент Тритон Х-100, из МХ мембраны печени крыс выделили белок с м.м. 53 кДа [Diwan et al., 1988]. Реконструировав его в липосомы, авторы показали, что этот белок также обладает свойствами, характерными для К⁺ унипортера.

Известно, что в МХ помимо системы электрогеннного входа К⁺ существует система электронейтрального выхода К⁺ в обмен на Н⁺ [Garlid and Paucek, 2003]. При этом внешняя МХ мембрана не препятствует дальнейшему обмену небольшими ионами с цитоплазмой.

Система электрогенного входа калия и электронейтрального К⁺/Н⁺-обменника образуют К⁺ цикл МХ (Рис.1).

Рис. 1. МХ калиевый цикл по Garlid and Paucek, 2003. ЭТЦ – электрон-транспортная цепь; ММП – межмембранное пространство; Фн – неорганический фосфат.

Электрогенный выброс протонов электрон-транспортной системой генерирует мембранный потенциал, который, в свою очередь, стимулирует диффузию К⁺ в матрикс МХ («утечка калия» или К⁺ leak) и вход иона, опосредованный неким специфическим калиевым каналом. Такой обмен Н⁺ на К⁺ подщелачивает матрикс, вызывая вход фосфата по электронейтральному Фн-Н⁺ симпортеру (Фн – неорганический фосфат) (Рис.1).

Вход К⁺ сопровождается накоплением осмотически облигатной воды, что проявляется в набухании МХ. Излишнее их набухание может угрожать целостности этих органелл, следовательно, избыток К⁺ необходимо удалять. Эту функцию выполняет белок с м.м. 82 кДа - К⁺/Н⁺-антипортер [Brierley G., 1976; Garlid K., et al., 1980; 1988]. Следует отметить, что вход К⁺ путем диффузии слишком мал, чтобы существенно влиять на изменение объема матрикса МХ. Интенсивный вход калия в МХ обеспечивается специфическими белками, осуществляющими электрофоретический вход К⁺ в МХ [Mironova G., 1981; Diwan J., et al., 1988; Paucek et al., 1992].

1.1.3 Физиологическое значение транспорта калия в МХ

Предполагается, что основное физиологическое значение систем транспорта К⁺ в МХ связано с регуляцией объема МХ матрикса. Объем МХ определяется калиевыми токами через внутреннюю мембрану. Когда вход и выход К⁺ находятся в равновесии, калиевые потоки определяются электронейтральным током анионов и осмотически облигатной воды [Garlid, 1988]. Так как концентрация ионов калия в матриксе и в цитоплазме практически одинаковая, транспорт калия мало влияет на матриксную концентрацию калия, но может иметь большое влияние на объем МХ. Небольшое нескомпенсированное увеличение входа К⁺ в МХ может удваивать их объем в течение 1-2 минут [Garlid, 1979]. В свою очередь, увеличение матриксного объема стимулирует активность дыхательной цепи, что было показано на МХ сердца и печени [Nichols and Lindberg, 1972; Halestrap, 1989]. Окисление жирных кислот также чувствительно к изменению объема матрикса [Halestrap, 1987].