05. МОНОГИБРИДНОЕ, ДИГИБРИДНОЕ И АНАЛИЗИРУЮЩЕЕ СКРЕЩИВАНИЯ (Лекции по генетике)

ЛЕКЦИЯ 5. МОНОГИБРИДНОЕ, ДИГИБРИДНОЕ И АНАЛИЗИРУЮЩЕЕ СКРЕЩИВАНИЯ.

О.Э. Костерин, ИЦиГ СО РАН и ФЕН НГУ, Новосибирск, 2012 г.

5.1. Моногибридное скрещивание – определение.

Давайте рассмотрим то, что в генетике традиционно называется моногибридным скрещиванием (эта терминология идет от одного из переоткрывателей работы Менделя и генетики Гуго де Фриза), хотя логичнее его было бы назвать монолокусным или моногенным. Этим термином обозначается два поколения скрещиваний, в котором рассматривается поведение только пары аллелей одного какого-то локуса. При этом об отличиях по другим локусам ничего не известно или на них не обращается внимания. (Таким образом, гибридов-то в моногибридном скрещивании много – целых два поколения, а вот локус - всего один. Специально обращаю внимание на алогичность названия, чтобы вас не сбивала с толку этимология термина, и заодно вы лучше запомните, так как исключения всегда запоминаются легче правил.) Две гомозиготы по разным аллелям скрещивают между собой. Первые генетики как правило начинали свои опыты со скрещивания двух разных сортов или пород (отсюда и название, включающее корень «гибрид»), которые, как правило, гомозиготны по большинству локусов. В результате этого скрещивания получаются гибриды первого поколения, или гибриды F1. Затем гибриды первого поколения скрещиваются между собой по принципу брат-сестра. В генетике существует термин сиб, означающий «брат или сестра» (всего лишь «гибрид» слов sister и brother), то есть потомка одного и того же скрещивания безотносительно пола, так что можно сказать, что проводится скрещивание сибов (обращаю внимание, что некоторые неправильно говорят «сибсов», тогда как sibs – это множественное число английского языка). В случае растений, способных к самоопылению поступают еще проще – дают им опылить самих себя. В результате получаются гибриды второго поколения, это поколение принято называть F2. Итак, моногибридным скрещиванием называют два этапа скрещиваний, в которых обращается внимание на поведение аллелей одного локуса: на первом этапе скрещиваются контрастные гомозиготы, на втором – гибриды первого поколения между собой или сами с собой.

Поскольку все гаметы, образуемые гомозиготой по любому аллелю, несут только этот аллель, потомство F1 от скрещивания гомозигот по двум разным аллелям может быть только гетерозиготой по этим аллелям, таким образом все они будут иметь идентичный генотип в отношении данного локуса. Следовательно, поколение F2 мы получаем, скрещивая две одинаковые гетерозиготы между собой. Пусть это будут все те же гетерозиготы A a по аллелям, определяющим белые и красные цветки у гороха. Вот они растут, образуют бутоны, в которых происходит мейоз. В результате мейоза образуются гаметы, в каждую из которых попадает одна из каждой пары гомологичных хромосом. В школе вы все проходили основы генетики и знаете, что в потомстве такого скрещивания – родительские фенотипы А и а возникают в соотношении 3 : 1. Однако я бы хотел обратить ваше внимание на некие тонкости, которые, как может показаться, не имеют особого практического значения, но очень важны теоретически, поскольку иногда встречаются наивные генетики, которые усматривают проблемы, исполненные биологического смысла, в том, что является всего лишь проявлением закономерностей теории вероятностей.

Какова вероятность того, что в отдельно взятую гамету попадет именно аллель А? Попадание разных аллелей в разные клетки происходит в первом делении мейоза, во втором делении мейоза гамета с вероятностью 1 наследует тот аллель, который попал в предковую для нее клетку диады. Исключим мейотический драйв, то есть сделаем логичное допущение, что ген а у нас никак не влияет на судьбу хромосом и клеток в мейозе (а таково большинство генов), следовательно попадание в одну из клеток диады аллеля А или а зависит от случая и эти события равновероятны. Вычислим вероятности того, что отдельно взятая гамета окажется принадлежащий к одному из этих двух классов. Обозначим их как p(A) и p(a). Эти вероятности равны, вероятности всех возможных в той или иной ситуации исходов (полная группа событий) в сумме должны равняться еднице. Исхода у нас два – A и a. Значит, мы имеем систему двух простейших линейных уравнений:

p(A) = p(a),

p(A) + p(a) = 1.

Отсюда получаем

p(A) = p(a) = 1/2.

Эти два значения вероятности двух единственно возможных исходов уде представляют собой особое распределение – распределение Бернулли. Попадание в отдельно взятую клетку диады аллеля А полностью аналогично подбрасыванию монетки и представляет собой испытание Бернулли с вероятностью успеха 1/2. Распределение Бернулли описывает количество успехов в одном испытании Бернулли, задано на множестве всех возможных исходов, включающих всего два значения – 0 и 1, имеет среднее p и дисперсию p (1-p). Итак, мы имеем тривиальнейший вывод – аллель А попадает в отдельно взятую гамету с вероятностью 1/2 – который легко было получить в уме без всякой системы уравнений. Зададим теперь себе несколько не менее простых вопросов.

5.2. Частота аллеля в продуктах женского мейоза гетерозиготы.

Рассмотрим по отдельности мужской и женский мейоз и начнем с женского. Возьмем все множество яйцеклеток, образованных данным растением – гетерозиготой A a - и зададимся вопросом – какова среди них доля тех, которые несут аллель А, иными словами – какова доля носителей аллеля А среди гамет? Наверняка сейчас прозвучит версия 1/2. Но это означало бы, что если растение произведет 101 зародышевый мешок, то аллель А будет нести 50,5 мешков, чего быть не может. Прозвучали слова «это в среднем». Раз можно говорить о среднем, то бывают и отклонение – налицо случайная величина. Случайная величина исчерпывающим образом характеризуется своим распределением. Какое распределение имеет случайная величина «частота аллеля А в зародышевых мешках»? Распределение вероятности k успехов в n испытаниях Бернулли, то есть сумма n распределений Бернулли, называется биномиальным распределением, с параметрами k и n. Его носителем является последовательность целых чисел от 0 до n, и оно определяется двумя параметрами: p – вероятность успеха в одном испытании Бернулли, и n – количество испытаний Бернулли, то есть объем выборки. Его матожидание («среднее») Mat (k) есть np, его дисперсия есть np(1-p). Сама вероятность k успехов в n испытаниях Бернулли (обозначим ее P( (k)) описывается простой формулой

P (k) = C^k_n р^k (1-p)^n-k.

В нашем случае p=1/2, поэтому среднее количество зародышевых мешков, несущих аллель А, есть n/2 (для n=101 мешков Mat (k) = 50,5, в точности как сказано выше), дисперсия есть n/4, среднеквадратическое отклонение есть квадратный корень из этой величины – в нашем случае это приблизительно 5,023. Для 100 мешков среднее будет 50, среднеквадратическое отклонение – 5. Заметим, что значение p нам известно заранее и точно из механизма мейоза, нам не нужно делать его оценки на основании нашей выборки и, соответственно, не нужны никакие поправки на смещение от объема выборки.

Плотность биномиального распределения с параметрами p=1/2, n=100 показана на следующем рисунке:

Каждому реализовавшемуся количественному соотношению женских гаметофитов, несущих аллели А и а, соответствует своя вероятность. Это в частности означает, что если мы делаем n испытаний – то есть берем n гамет, то с некоторой ненулевой вероятностью можем получить любое число k носителей аллеля А от 0 до n, то есть может получиться и так, что мы не получим ни одного носителя А, и так, что все гаметы окажутся носителями А. Согласно биномиальному распределению, вероятность такого результата есть pⁿ, а это значит, что эта вероятность стремительно падает с увеличением объема выборки (n). Если у нас есть 100 женских гаметофитов, произведенных гетерозиготой, то вероятности того, что все они, будут нести аллель А, составит 7.9 х 10^-33, с такой же вероятностью аллель А не будет нести ни один гаметофит.

Часто удобнее говорить не о количестве носителей аллеля А, k, а об их экспериментальной частоте, f = k/n. Вероятность получить конкретную частоту (область опроеделения которой в данной модели все еще дискретна) описывается формулой

P (k/n) = C^k_n р^k (1-p)^n-k/n

Матожидание частоты носителей А будет равно p – в нашем случае это 0,5; дисперсия – p(1-p)/n, среднеквадратическое отклонение – sqrt (p(1-p)/n). (Кстати, матожидание частоты носителей f при n испытаниях Бернулли можно рассматривать как выборочное среднее количества носителей в одном испытании, а величину sqrt (p(1-p)/n) – как ошибку среднего распределения Бернулли, то есть стандартную ошибку. И действительно, она получается путем извлечения корня из дисперсии количества носителей в одном испытании Бернулли, которая есть p(1-p), деленной на объем выборки n.) В выборке из 100 гамет, среднеквадратическое отклонение частоты носителей составит 0,05. Мы видим, что в формуле среднеквадратического отклонения частоты объем выборки n стоит в знаменателе. Если n велико, то реальные полученные в опыте частоты k/n приближаются к теоретическим вероятностям со все большей точностью. Но при этом вероятность точного совпадения экспериментальных частот с вероятностями как раз уменьшается. Например, вероятность получить частоту строго 1/2 (фактическая частота совпадает с вероятностью) на выборке из 10 гамет (когда 5 из них несут аллель А), есть число сочетаний из 10 по 5, то есть

(10!)/(5!)², умноженное на 1/2¹⁰ , что составляет около 0,25 (25%), тогда как то же самое на выборке из 100 гамет (когда ровно 50 из них несут аллель А), есть число сочетаний из 100 по 50, то есть (100!)/(50!)² умноженное на 1/2^100. , что составляет всего около 0,08 (8%). Это происходит оттого, что та же самая вероятностная масса, в сумме равная 1, при увеличении n делится на все большее количество возможных исходов.

5.3. Частота аллеля в продуктах мужского мейоза гетерозиготы

А какова частота аллеля А в мужском мейозе? 1/2. Это строгая цифра, которая случайной величиной не является. И если вас спросят какова будет частота аллеля А, если всего образовалось 101 пыльцевое зерно, или даже , 90 пыльцевых зерен, то вы должны ответить, что с точки зрения механизма полового размножения такого просто не бывает. Каждый мужской мейоцит дает 4 пыльцевых зерна, поэтому общее количество образовавшейся пыльцы должно быть кратно 4. Естественно, в жизни и количество пылинок может быть не кратно 4, и частота аллеля А может быть не тождественно равна 1/2, но это означает, что вмешались какие-то дополнительные факторы, не связанные с половым процессом и не учтенные в нашей совершенно строгой модели – какие-нибудь вредители поели пыльцу и т. п.

5.4. Частота аллеля среди гамет, участвующих в размножении при скрещивании гетерозигот.

Давайте теперь предоставим гетерозиготе опылить саму себя (у гороха это магистральный путь размножения), либо же скрестим две гетерозиготы. Рассмотрим образование одной единственной случайно выбранной зиготы. Примем еще одно допущение, опять-таки почти всегда выполняющееся на практике, что аллели, имеющиеся в гаметах, никак не влияют на процесс оплодотворения. Тем не менее, если в мейозе мы имели случайное событие – расхождение гомологов, то при оплодотворении мы имеем другое и независимое случайное событие – объединение аллелей в одну клетку. Какова вероятность, что зигота получит от отца аллель А? К моменту оплодотворения гаметофиты обоего пола уже сформировались и они уже таковы, каковы есть. Поэтому если рассматривать строго, то эта вероятность для каждой из зигот не является независимой. Доведем ситуацию почти до абсурда, но без потери биологического смысла: допустим, в цветке образовалось 5 семяпочек и 12 пыльцевых зерен (теоретически такое возможно). Как мы знаем, среди этих 12 пыльцевых зерен 6 несут аллель A, а 6 – аллель а. Допустим, 4 из 5 пыльцевых мешков были оплодотворены носителями аллеля А – чисто случайно возможно и такое. Тогда для 5го пыльцевого мешка остается 6 носителей аллеля a и всего 2, то есть в три раза меньше, носителей аллеля А. В статистике эта ситуация называется «выборка без возвращения», так как соответствует модели мешка, наполненного черными и белыми шарами, которые мы достаем оттуда, не возвращая. В этой ситуации имеет смысл рассматривать такую случайную величину как количество носителей аллеля А среди тех n мужских гаметофитов, которым посчастливилось поучаствовать в оплодотворении. Эта случайная величина – назовем ее k - описывается так называемым гипергеометрическим распределением. Оно зависит от уже трех параметров – n – объем нашей выборки (у нас – количество образовавшихся зигот), N – объем генеральной совокупности (общее количество пылинок) и M – количество «нужных» объектов в генеральной совокупности (у нас – количество носителей аллеля А среди всей пыльцы). Его среднее есть nM/N; в случае мужского мейоза, когда M строго вдвое меньше N, оно совпадает со средним биномиального распределения для равновероятного исхода, n/2. Дисперсия вычисляется сложнее: n(M/N)(1-M/N)(N-n)/(N-1).

M/N соответствует p в предыдущем примере (это доля носителей А в генеральной совокупности), так что дисперсия гипергеометрического распределения отличается от дисперсии биномиального распределения лишь множетелем (N-n)/(N-1). При больших N и много меньших n, упомянутый множитель приближается единице, поэтому результаты выборки с возвращением практически неотличимы от выборки без возвращения. В мужском мейозе эти условия почти выполняются. В случае мужского мейоза значение М/N известно точно и есть 1/2. Получаем формулу для дисперсии n(N-n)/4(N-1). Если у нас было 1000 пылинок и завязалось 100 горошин, то мы получаем ~90 /4 = 22,5. Как видим, дисперсия несколько меньше, чем 25 в случае биномиального, то есть разброс результата будет меньше. (Его можно оценить с помощью среднеквадратического отклонения, которое здесь составит 4,74 – сравним с 5 у биномиального распределения.) И это неудивительно – наша система более предсказуема, чем подбрасывание монетки, поскольку общее количество носителей аллеля А у нас уже фиксировано, и если у нас много раз выпала «решка», это будет скомпенсировано и потом будут выпадать «орлы», чего как раз не наблюдается при подбрасывании монетки. В этой системе уже можно руководствоваться соображениями типа «бомба два раза в одну воронку не падает», которое как раз совершенно несправедливо в отношении бомбы.

А как обстоят дела в женском мейозе? С одной стороны точно так же – мейоз прошел до оплодотворения, мы снова имеем случайную величину k женских гаметофитов, участвующих в размножении, описываемую тем же гипергеометрическим распределением. Однако, как мы убедились выше, в этом случае М является уже не константой, а случайной величиной, потому что количество носителей аллеля А среди N зародышевых мешков уже не строго N/2, а описывается биномиальным распределением для выборки объемом N с вероятностью успеха 1/2. Действительно, число носителей аллеля А среди яйцеклеток, участвующих в размножении, есть результат двух строго последовательных случайных событий, связанных с двумя этапами полового процесса – мейоза и оплодотворения. В формулах для моментов распределения случайной величины, возникающей в момент оплодотворения, следует подставлять значения другой случайной величины, возникшей в момент второго деления мейоза. Эта случайная величина, в свою очередь, имеет свою дисперсию. Дисперсия суперпозиции двух случайных величин превышает дисперсию каждой из них.