1625912753-9924f6a9b879d980d6ddf630afb8d4ef (Э1)

Э-1. Гель-электрофорез ДНК

Приборы и реактивы:
1) камера для электрофореза фирмы BioRad (США)
2) УФ-прозрачная гелевая рамка для заливки геля и проведения электрофореза
3) заливочный столик с резьбовым зажимом
4) гребенка толщиной 1 мм на 8 карманов
5) источник постоянного тока фирмы BioRad (США)
6) система гель-документации BioRad (США)
7) автоматические пипетки и носики на них
8) пробирки типа «Эппендорф»
9) агароза фирмы Кох-Лайт (Англия)
10) ДНК фага лямбда (концентрация ≈ 500 мкг/мл)
11) маркер ДНК лямбда / HindIII (концентрация ≈ 500 мкг/мл)
12) раствор этидия бромида – 5 мкг/мл
13) 0,002% раствор бромфенолого синего и 50 мМ ЭДТА в 50% глицерине
14) буфер для электрофореза (40 мМ трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0)

Экспериментальная часть

Приготовление 1% агарозного геля

1. 0,5 г агарозы поместили в коническую колбу, добавили 50 мл буферного раствора для электрофореза и довели до кипения в микроволновой печи (≈1мин) до получения однородной массы. Остудили раствор до 50-60 ⁰С.

2. Гелевую рамку поместили на заварочный столик и зажали при помощи зажимов. Аккуратно вывили в форму горячий раствор агарозы и сразу вставили вертикальную гребенку в пазы на гелевой рамке примерно в 2 см от начала геля – создание карманов для нанесения образцов на гель.

3. После затвердевания геля (20-30 мин) осторожно удалили гребенку, ослабили зажимы заливочного столика и перенесли гель вместе с гелевой рамкой в камеру для электрофореза так, чтобы «карманы» в будущей ДНК были вблизи «-».

4. Залили гель буферным раствором так, чтобы гель был покрыт раствором в 5 мм.

Приготовление образцов

1. Внесли в две пластиковые пробирки автоматической пипеткой по 30 мкл буферного раствора и по 10 мкл раствора бромфенолового синего.

2. В первую пробирку добавили 3 мкл раствора ДНК, во вторую – 4 мкл раствора маркера ДНК лямбда / HindIII, перемешали, «сбросили» раствор на дно пробирки внучную.

Проведение электрофореза

1. Микропипеткой по 10 мкл внесли ДНК в два кармана и по 10 мкл внесли в два кармана маркеры

2. Закрыли крышки камер для фореза. Подключили электроды к источнику постоянного тока, установили на приборе 85 В, включили напряжение.

3. Дождались, когда краситель пойдет 2/3 длины геля, отключили напряжение.

4. Осторожно в перчатках вынули гель вместе с краской и положили в пустую кювету отдельно гель. Залили раствор бромистого этидия.

5. Через 30 минут вынули гель. Гель отмыли дистиллированной водой

6. Поместили гель в систему документации для обнаружения полос ДНК и ее фрагментов. В программе провели сканирование геля и сохранили результаты

Результаты

Длина кольцевой молекулы ДНК = 48502 пар оснований
средняя масса нуклеотидов 345

lnU=1/m

Бэнд ДНК и первый бэнд маркера, соответствующий длине 23 130, находятся на одном уровне, так как ДНК кольцевая релаксирована, что укорачивает ее.Релаксироанная ДНК продвигается быстрее в геле, чем линейная того же веса. Но ДНК в эксперименте имеет больше пар оснований, чем линейная у маркера, что компенсирует скорость прохождения, поэтому бэнды на одном уровне.

Фрагменты 564 и 125 не зарегистрированы на фото, что может быть связано с чувствительностью настройки, но, вероятно, эти участки перегнались и вышли из геля из-за их малого веса.