hill (Методички к практикуму по физиологии растений)
Описание файла
Файл "hill" внутри архива находится в папке "Методички к практикуму по физиологии растений". Документ из архива "Методички к практикуму по физиологии растений", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "физиология растений" из 6 семестр, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. .
Онлайн просмотр документа "hill"
Текст из документа "hill"
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ПОТОКА ЭЛЕКТРОНОВ
В ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ ХЛОРОПЛАСТОВ
КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
(реакция Хилла)
Объект: листья гороха посевного Pisum sativum L.
Цель: определить скорость потока электронов в электрон-транспортной цепи фотосинтеза по скорости восстановления искусственного акцептора электронов (K3Fe(CN)6) колориметрическим методом при:
а) базальном транспорте;
б) сопряжённом транспорте.
Ход работы:
ВЫДЕЛЕНИЕ ХЛОРОПЛАСТОВ
(ВНИМАНИЕ! Все процедуры выделения хлоропластов ведут при 0–5° С).
1. Получение гомогената.
Навеску листьев 4 г (предварительно охлажденных в холодильнике в течение 10–15 минут
в полиэтиленовом пакете или во влажной фильтровальной бумаге) растирают в фарфоровой ступке на льду в течение 1–2 минут с 25 мл среды выделения (0,30 М NaCl в 0,06М фосфатном буфере рН 8,04). Полученный гомогенат фильтруют через капроновое полотно
в центрифужную пробирку.
2. Получение суспензии хлоропластов методом дифференциального центрифугирования.
Фильтрат в центрифужной пробирке уравновешивают другой центрифужной пробиркой
с водой. Проводят центрифугирование при 5000 об/мин в течение 2 минут. Супернатант отбрасывают, а осадок, содержащий хлоропласты, аккуратно размешивают кисточкой
в центрифужной пробирке с 25 мл среды выделения.
(ВНИМАНИЕ! Суспензию хлоропластов хранить в течение всех экспериментов в темноте на ледяной бане).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ПОТОКА ЭЛЕКТРОНОВ
Варианты:
1, 2) Свет + АДФ (2 повторности) — сопряженный поток электронов
3, 4) Свет – АДФ (2 повторности) — базальный поток электронов
5) Темнота + АДФ — контроль
6) Темнота – АДФ — контроль
Опыты проводят в конических колбах небольшого объёма. В каждую колбу наливают реакционную смесь. Состав реакционной смеси (на 1 колбу):
Компоненты смеси | + АДФ | АДФ |
среда выделения | 2,8 мл | 2,9 мл |
MgCl2 | 0,1 мл | 0,1 мл |
K3Fe(CN)6 | 1,0 мл | 1,0 мл |
АДФ | 0,1 мл | — |
суспензия хлоропластов | 1,0 мл | 1,0 мл |
Темновые варианты помещают в темноту на 10 мин, а световые освещают в течение 10 мин
на спец. установке. После выключения света во все варианты (и темновые, и световые) сразу добавляют по 1 мл 20% ТХУ (трихлоруксусная кислота) и 2 мл 1М CH3COONa для того, чтобы остановить реакцию. (!) После каждого добавления тщательно перемешивать.
Пробы фильтруют через двойные бумажные фильтры в стаканчики.
Оптическую плотность полученных фильтратов измеряют на ФЭКе при 400 нм. Контроль — вода (lкюв.= 0,5 см).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ХЛОРОФИЛЛА В СУСПЕНЗИИ ХЛОРОПЛАСТОВ
В мерную пробирку вносят 0,5 мл суспензии хлоропластов, 1,5 мл дистиллированной воды, 100%-ым ацетоном доводят объём до 10 мл. Раствор хорошо перемешивают и фильтруют
в коническую мерную пробирку через стеклянный фильтр № 2 или № 3. Доводят объём фильтрата до 10 мл 100%-ым ацетоном, перемешивают. Полученный фильтрат промеряют на спектрофотометре при длине волны 652 нм (контроль — 80% ацетон). Концентрацию хлорофилла в суспензии хлоропластов рассчитывают по формуле Арнона (Arnon, 1949):
cChl = 0,58 * D652 [мг Chl/мл суспензии]
РАСЧЁТ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ СКОРОСТИ ПОТОКА ЭЛЕКТРОНОВ В ЭТЦ ХЛОРОПЛАСТОВ
Количество (мкмоль) восстановленного K3Fe(CN)6 определяют по формуле:
(D400 темнота + АДФ ― D400 свет + АДФ) * V [мл]
ν = ————————————————— = [мкмоль K3Fe(CN)6] при сопряжённом транспорте
ε400 [л ммоль-1 см-1] * l [см]
(D400 темнота ― АДФ ― D400 свет ― АДФ) * V [мл]
ν = ————————————————— = [мкмоль K3Fe(CN)6] при базальном транспорте
ε400 [л ммоль-1 см-1] * l [см]
V = 8 мл — объём раствора
ε400 = 1,04 л ммоль-1 см-1 — коэффициент милимолярной экстинкции K3Fe(CN)6 при λ = 400 нм;
l = 0,5 см — длина оптического пути (= толщина кюветы)
мкмоль K3Fe(CN)6
Скорость потока электронов в ЭТЦ vсопр. и vбаз. выражают в [—————————].
мг хлорофилла ∙ час
В выводах указать рассчитанные скорости сопряжённого (vсопр.) и базального (vбаз.) транспорта электронов, соотношение скоростей vсопр./vбаз. Объяснить результаты на основе теоретических знаний о работе ЭТЦ.
Литература:
Физиология растений: учебник для студ. вузов. Под ред. И.П. Ермакова. — М.: Издательский центр "Академия", 2005 или 2007:
-
электрон-транспортная цепь фотосинтеза — с. 163-179, 185-190;
-
АТФ-синтаза — с. 95-99.