2

Рост и развитие

• Задача 1.

• Биотест для определения биологической активности веществ ауксиновой природы.

Биотест (биопроба) – это метод обнаружения и определения активности гормонов и фенольных ингибиторов по реакции целых растений, их органов, тканей и клеток, обладающих повышенной специфической чувствительностью к этим соединениям. Биотесты используют для 1) качественного обнаружения фитогормона в смесях неизвестных веществ; 2) оценки количества гормона или фенольного ингибитора в исследуемой смеси; 3) обнаружения (или изучения) физиологических процессов, в которых участвуют физиологически активные вещества; 4) анализа свойств новых синтетических регуляторов роста.

Объекты, используемые для биотеста должны удовлетворять следующим требованиям: 1) стандартность исходного материала и его ответных реакций; 2) легкая воспроизводимость результатов; 3) высокая чувствительность к данному веществу. Тест-объект должен реагировать на маленькие концентрации исследуемого вещества, а это возможно при низкой исходной концентрации вещества в клетках; 4) специфичность (ответные реакции только на определенную группу физиологически активных веществ).

По характеру физиологических реакций, вызываемых гормонами, биотесты делят на группы: ростовые, пигментные и ферментные. Ростовые: изгибание и удлинение отрезков стеблей или колеоптилей у злаков, рост каллуса, прорастание семян. Пигментные: синтез хлорофилла (зеленение листьев), накопление каротиноидов. Ферментные: гормоны могут стимулировать синтез ферментов, например α-амилазы. [1]

Ауксины - гормоны, вырабатываемые в апикальных меристемах побегов. Наиболее чувствительны к ауксинам корни, затем почки и, наконец, стебли растений. Установлено, что низкие концентрации ускоряют, а высокие тормозят рост этих частей растений. Ауксины влияют на рост в фазе растяжения, тропизмы, дифференцировку ксилемы и закладку корней, апикальное доминирование, опадание листьев, цветение, рост пыльцевых трубок, завязывание и рост плодов, образование клубней и луковиц, прорастание семян. [2]

Кроме природных ауксинов химикам удалось синтезировать вещества, вызывающие такой же физиологический эффект. Поскольку они не встречаются в растениях, их называют синтетическими аналогами ауксинов. Среди них упомянем лишь 2,4-Дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) и -нафтилуксусную кислоту (НУК). Синтетические аналоги эффективно связываются с рецепторами ауксина, однако слабо взаимодействуют с системой транспорта или окислительной деградации естественных ауксинов.

• Цель задачи: изучить влияние ауксинов на прорастание семян капусты.

• Объект исследования:

• Реактивы и оборудование. Стерильные колбы с агаризованной средой Мурасиге и Скуга (МS) 300 мл, 70%-ый раствор этилового спирта; диметилсульфоксид (DMSO), раствор β-индолилуксусной кислоты (ИУК) (4мг в 1000мкл DMSO), 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) (5мг в 1500мкл DMSO) либо α-нафтилуксусной кислоты (НУК) (3мг в 1500мкл DMSO); стерильный раствор 5% Н₂О₂ на 96⁰ этиловом спирте; автоматические пипетки (5-40мкл и 40-200 мкл) и стерильные наконечники, стерильные пробирки Эппендорф (объемом 1,5 мл), стерильные стаканчики на 50 мл, стерильные чашки Петри (5 шт. диаметром 9 см и 1шт. диаметром 6см), стерильные фильтры, ножницы, пинцеты, парафилм или пленка.

• Ход работы:

1. Плавят на водяной бане агаризованную среду.

2. Подготавливают ламинар-бокс к работе: включают продувку воздуха ламинар-бокса на 5 мин, протирают всю внутреннюю поверхность ламинар-бокса 70% спиртом. После этого приступают к работе. Продувка ламинара продолжается в течение всей работы.

3. Рассчитывают величину вносимого в среду объема гормона для каждого варианта концентрации (на 50мл среды).

   	Концентрация гормона [мг/л]	контроль 0	0,002	0,02	0,2	2
   ИУК / 2.4D / НУК	вносимый V исходного р-ра [мкл]
   	вносимый V разведенного р-ра [мкл]
   DMSO	V [мкл]

4. Перед работой моют руки и протирают их спиртом.

5. Все последующие процедуры проводят в стерильных условиях в ламинаре. (Закрывание/открывание эппендорфов, открывание стаканчиков с помощью предварительно обожженного над горелкой пинцета и т.д.).

6. (Если необходимо, готовят исходный раствор фитогормона нужной концентрации.)

7. Отливают 50 мл среды в стаканчик. Пробку с колбы снимают в стерильных условиях. Перед тем как отлить питательную среду, горло колбы обжигают над горелкой.

8. Добавляют концентрированный раствор гормонов в необходимом объеме (для получения следующих концентраций фитогормона в среде: 0,002 мг/л, 0,02 мг/л, 0,2 мг/л или 2 мг/л) в стаканчик со средой, контроль не содержит гормона.

9. Добавляют необходимый объем растворителя (DMSO). Перемешивают среду.

10. Переливают среду в чашку Петри в стерильных условиях (перед тем как перелить питательную среду, горло стакана обжигают над горелкой), накрывают крышкой.

11. Оставляют среду застывать при комнатной температуре.

12. Повторяют все для каждой концентрации гормона (с 5 по 8 пункты).

13. Стерилизуют растительный материал по схеме:

Заранее готовят стерильный раствор 5% Н₂О₂ на 96⁰ этиловом спирте и хранят в темноте.

Семена раскладывают в один слой в 6см чашку Петри на стерильный бумажный фильтр и с помощью пипетки наносят раствор по капле на 3 минуты (пока не испарится спирт).

1. Семена сажают в 9см чашку Петри пинцетом, по 25-30 семян (семена можно не промывать после стерилизации).

2. Герметизируют чашки Петри парафилмом или пленкой. Дальнейшую работу можно проводить в нестерильных условиях.

3. Надписывают чашки Петри (указывают группу, число посадки, название и концентрацию гормона).

4. Чашки помещают на 16-ти часовой световой день и t=+20⁰С.

5. Через две недели визуально оценивают различия проростков в чашках с различной концентрацией гормона, если есть фиксируют нарушения геотропизма, проводят измерения гипокотиля и корня каждого выросшего растения, отмечают, если произошло заражение.

Полученные результаты заносят в таблицу, проводят статистический анализ (подсчет средних значений и стандартных отклонений для оценки достоверности полученных результатов), строят графики зависимости длины гипокотиля/корня от концентрации в среде ИУК/2,4D/НУК. Объясняют результаты.

ЛИТЕРАТУРА к зачету:

Полевой В.В. «Физиология растений»: Учеб. для вузов. М.: "Высш. шк.", 1989.

Бутенко Р.Г Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.

Медведев «Физиология растений»

Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений // 35—е Тимирязевское чтение. М., 1985.

Гудвин Т., Месер С. Введение в биохимию растений. Т 1,2. М., Мир, 1986.

Гэлстон К., Девис П., Сэттер Р. Жизнь зеленого растения. М., 1983.

Дерфлинг К. Гормоны растений. М., 1985

Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка// 41-е Тимирязевское чтение. М., 1982.

Полевой В.В. Фитогормоны. Л., 1982.

Полевой В.В. Роль ауксина в системах регуляции растений // 44-е Тимирязевское чтение. Л., 1986

Уоринг Ф., Филлипс И. Рост растений и дифференцировка. М., 1984.