KUL_TIVIROVANIE_I_ROST (Комплект полезных материалов по микробиологии)

Закономерности роста чистых культур при периодическом перемешивании. Кривая роста, особенности отдельных фаз. Рост микроорганизмов при непрерывном культивировании.

Математическое выражение роста культур в непрерывных условиях. Значения непрерывного культивирования для изучения свойств микроорганизмов и для их практического использования. Синхронные культуры, способы получения и значение.

1. Культивирование. Накопительные культуры и принцип селективности. Чистые культуры микроорганизмов. Методы получения и изучение. Основные типы сред, используемые для культивирования микроорганизмов (по составу и физическому состоянию). Культивирование аэробных и анаэробных микроорганизмов, метод Хангейта. Поверхностное и глубинное выращивание.

Культивирование микроорганизмов проводится с целью увеличить кол-во материала (работа с популяцией микроорганизмов).

Накопительные культуры:

Накопительной называют такую культуру, в которой преобладают предста­вители одной физиологической группы или даже одного вида микроорганиз­мов (за счет накопления определенной группы в селективных условиях, где другие группы либо не размножаются, либо характеризуются незначительным ростом). Специфические питательные сре­ды, удовлетворяющие потребности преимущественно одной группы микроор­ганизмов- элективные=селективные (среда Эшби является элективной для рода Azotobacter).

Чистые культуры:

Она может быть получена из отдельной колонии или одной клетки (клетки одного вида).

Посев по Коху: накопитель­ную культуру высевают на поверхность плотной среды.

Расплавленную на кипящей водяной бане стерильную и охлажденную до 50 питательную среду, содержащую агар или желатину, в сте­рильные чашки Петри. После застывания на поверхность наносят каплю культуры и растирают шпалелем,потом этим же шпателем растирают в 2-й,3-й,4-й чашках.

Так же можно посеять истощающим способом петлей (как сеяли на практикуме,делим на сектора чашку, и захватывая одну линию траектории, размазываем по секторам. Перед каждым размазыванием петлю прожигают

После посева в термостат крышками вниз,что бы конденсат не закапал среду.

Выросшие изолированные колонии отсевают петлей на поверхность скошенной плотной среды в пробирке или в жидкую среду.

Типы сред:

1). По физическому состоянию могут быть

• жидкими, применяют для выявления физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, накопления биомас­сы или продуктов обмена, а также поддержания и хранения многих микроорга­низмов, плохо развивающихся на плотных средах.

• полужидкими, реды получают добавлением к жидким средам 0,5 % агара и используют для специальных це­лей, например культивирования анаэробных микроорганизмов.

• твер­дыми (плотными) Они необходимы для выделе­ния чистых культур микроорганизмов, в диагностических целях, для количе­ственного учета микроорганизмов, хранения культур и в ряде других случаев.

• сыпучими.(Стан­дартность, простота хранения, транспортировки и изготовления делают их весьма удобными для работы).

2). по химическому составу:

На мономерах, к.пр., нельзя создать селективную среду, на части полимеров тоже (крахмал, большая часть белков); хитин, коллаген-селективны. В среде должны присутствовать необходимые питательные вещества: фосфаты, различные макро- и микроэлементы (Cl,K,Na,Ca,Mg,Fe,…).

Стандартная неселективная среда – БСА: мясо-пептонный бульон (МПБ) и неохмеленное пивное сусло с концентрацией сахара 4град. (в соотношении 1:1) с 2% агара.

Для создания селективных условий необходимо добавление в среду специфических веществ, например, при выращивании азотфиксаторов, не нужно добавлять азот (=> вырастут те, кто умеет улавливать его из воздуха); нитрификаторы – NH₄,NO₂; денитрификаторы – NO₃; сероокисляющие бактерии- S; сульфатредукторы – сульфаты; серные бактерии – H₂S, …

Культивирование аэробных и анаэробных микроорганизмов:

на поверхности жидких и плотных сред — поверхностное культивирование или внутри жидкой питательной среды — глубинное культиви­рование. При поверхностном культивировании кислород в клетки из воздуха,использовать ч петри или колбы Виноградова.

При глубинном культивировании среду надо аэрировать

При аэрации два показателя: интенсивность и степень аэрации. Интенсивность аэрации характеризуется скоростью растворения кис­лорода в единице объема культуральной жидкости за единицу времени. Сте­пень аэрации — это объем воздуха, продуваемый через определенный объем среды за единицу времени.

Наиболее простой и широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования — выращивание на качалках+отбойники в колбах

2). Анаэробные микроорганизмы:

более сложно, чем культи­вирование аэробов, так как соприкосновение клеток анаэробов с кислородом воздуха должно быть сведено к минимуму или даже полностью исключено.

Выращивание в высоком слое среды.

Метод культивирования в вязких средах. Вязкость сред легко увели­чить добавлением к ним 0,2— 0,3 % агара.

Для получения изолированных колоний при выделении чистых культур или определении их численности анаэробные микроорганизмы выращивают в толще питательной среды.

Анаэробные микроорганизмы можно выращивать в анаэростатах — ваку­умных металлических камерах, снабженных манометром.

Метод Хангейта:

Культивирование строгих анаэробов.

1) все процедуры — приготовление и разлив сред, посевы, культивирование микроорганизмов и т.д., проводят с максимальной защищенностью от контакта с кислородом (анаэробный бокс, кипячение, работа в токе стерильного газа, использование герметически закрытых сосудов и т.д.); 2) до посева микроорганизмов в среды добавляют восстановители (цистеин, сульфид натрия, тиогликолат в щелочной среде) для химического поглощения следов кисло­рода, диффундирующего в сосуды для культивирования даже через резиновые пробки; 3) все пересевы и добавки в среды проводят с помощью шприцев, проду­тых газом, не содержащим кислород; 4) все трубки и шланги, используемые для пропускания газа, должны быть изготовлены из материала, не допускающего (медь) или допускающего в слабой степени диффузию сквозь него кислорода воздуха (бути-лированная резина).

В качестве поглотителя кислорода из газов в лабораторной практике используют щелочные растворы пирогаллола или дитионита натрия, металлическое железо, медь, нагретую до 400 °С, или некоторые другие реактивы.

Для удаления следов кислорода из промышленных газов, которые поставляют в баллонах, содержащих до 1,5 % воздуха, используют следующую процедуру: газ про­пускают через стеклянную трубку, заполненную медными стружками и нагретую до 400 °С с помощью электронагревателя .

2. Рост микроорганизмов. Рост отдельных микроорганизмов и популяций (культур). Сбалансированный и несбалансированный рост. Возможные причины несбалансированного роста. Основные параметры роста культур: время генерации, удельная скорость роста, выход биомассы, экономический коэффициент.

Периодическое культивирование.

Лаг-фаза — фаза «привыкания» клеток к среде удлиняется, если использовать старый посевной материал и переносить клетки в совершенно новую по составу среду. Лаг-фаза сокращается (или может совсем отсутствовать), если активные молодые клетки из экспоненци­альной фазы роста перенести в свежую среду того же состава и той же температуры. На средах, содержащих смесь субстратов, на­блюдается диауксия

В экспоненциальной (логарифмической) фазе клетки растут и де­лятся с максимальной скоростью, их рост не ограничен. Обычно такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях.

По мере исчерпания субстратов и накопления продуктов обме­на скорость роста снижается (фаза замедления роста) и культура переходит в стационарную фазу, а затем – в фазу отмирания, которая иногда также имеет лога­рифмический характер.

Экспоненциальный микробный рост изображается на полуло­гарифмическом графике в виде прямой линии. Важной характери­стикой культуры является константа скорости роста — ц, кото­рая зависит от условий выращивания (если условия стандартные, то для данной культуры она совершенно определенная).

Если рассматривать популяцию не как набор индивидуальных особей, а как саморазмножающуюся систему, то скорость изме­нения плотности такой системы пропорциональна самой плотно­сти, т.е. изменение следует кинетике реакций первого порядка. Тогда имеем

Различают сбалансированный рост, когда увеличение всех вешеств и структур происходит пропорционально. Если в среде нехватка или избыток чего-нибудь, то рост становится несба­лансированным, т.е. какие-то продукты метаболизма могут преобладать. Этим приемом пользуются для направленного синтеза не­обходимых соединений.

Время генерации = время удвоения: G=t/n=1/v, где n-число делений, v-константа скорости деления;

выход биомассы: М=Мmax-М_{0(исходн.);}

экономический коэффициент: Y=М/S(отношение выхода биомассы к потребленному субстрату).

3. Закономерности роста чистых культур при периодическом перемешивании. Кривая роста, особенности отдельных фаз. Рост микроорганизмов при непрерывном культивировании.

Математическое выражение роста культур в непрерывных условиях. Значения непрерывного культивирования для изучения свойств микроорганизмов и для их практического использования.

Проточная система культивирования по­зволяет зафиксировать культу­ру в какой-то определенной фазе (обычно экспоненциаль­ной). При этом состав среды и условия роста остаются посто­янными. Существуют два принципиально разных типа непре­рывных культур — хемостаг и турбидостат.

В хелюстате фиксируется какой-нибудь химический параметр процесса (концентрация субстрата, кислорода). Эта концентра­ция является лимитирующей.

Если объем сосуда обозначить череч V, а скорость притока ,/ (л/ч), то скорость разбавления определяется по формуле

Если скорость прироста it скорость вымывания раины, то сис­тема находится в состоянии динамического равновесии.

Зависимость константы скорости роста и от концентрации суб­страта С, описывается кривой насыщения,где Кх- концентрация субстрата,при которой мю равна маленькому выраженьицу ниже

Работа турбидостата основана на поддержании постоянной плотности бактериальной суспензии. Фотоэлемент измеряет плот­ность вытекающей суспензии и автоматически изменяет проток (чем плотнее культура, тем больше подается среды). В сосуде для культивирования все питательные вещества содержатся в избыт­ке, а скорость роста бактерий приближена к максимальной. При гаком принципе работы возникают технические проблемы при­стеночного обрастания поверхностей, в том числе и фотометри­ческой кюветы.

Синхронные культуры, способы получения и значение.

все клетки в популяции делилятся одновременно (синхронно).

Для этого используют различные приемы получения синхрон­ных культур:

и получение клеток одного размера путем фильтрации или нпфференциального центрифугирования;

• резкое изменение температуры инкубации;

• воздействие света и т.д.

При этом кривая роста получается ступенчатой Обыч­но удается синхронизировать не более трех делений, а потом культура снова переходит к асинхронному делению.