Azotofixatory (Комплект полезных материалов по микробиологии)

Свободноживущие азотфиксаторы

После разработки метода избирательной культуры Виноградскому в 1895 г. удалось выделить первую бак­терию, связывающую атмосферный азот. Это была анаэ­робная спорообразующая палочка, названнаяClostridiumpasteurianum. Присутствие в почве С. pasteurianum мож­но установить даже в школьной лаборатории, используя так называемые спонтанную и обогащенную культуры. По первому методу обычные пробирки заполняют смесью почвы с раствором сахарозы, хорошо уплотняя содержи­мое, чтобы создать анаэробные условия. После несколь­ких дней инкубации пробирок при комнатной температу­ре наблюдается выталкивание столбика почвы из пробир­ки газами, образовавшимися в процессе маслянокислого брожения, вызванного С. pasteurianum.
Дополнительным признаком присутствия Clostridium в культуре является неприятный запах масляной кислоты, образовавшейся при маслянокислом брожении, процессе с помощью кото­рого С. pasteurianum обеспечивает себе энергию. Он про­текает следующим образом:

С6Н1206 = СН3-СН2-СН,-СООН + 2С03 +

+ На + 18 ккал.

Спонтанная культура С. pasteurianum — это не чистая культура бактерии. В ней могут развиваться и другие анаэробы, использующие сахарозу как источник углеро­да и энергии.

Обогащенная культура больше отвечает требованиям избирательности, чем спонтанная. При ее разработке Ви­ноградский учел не только пищевые потребности С. pas­teurianum, но и некоторые ее физиологические свойства. Обогащенная культура С. pasteurianum создается путем инокуляции 2%-ного раствора сахарозы в водопроводной воде комочками почвы. Clostridiumpasteurianum — бак­терия, мало требовательная к питательным веществам. Солей, содержащихся в водопроводной воде, вполне до­статочно для ее роста и развития. Отсутствие азота в сре­де исключает развитие микроорганизмов, неспособных использовать азот воздуха. Сахароза превосходный ис­точник энергии для Clostridium. Это спорообразующая бактерия цилиндрической формы. Если питательную сре­ду, инокулированную комочком почвы и разлитую в вы­сокие пробирки, чтобы создать анаэробные условия, под­вергнуть пастеризации (нагреванию на несколько минут до 60—95°С), то тем самым будут убиты все вегетатив­ные формы бактерий, но споры выживут. В культуре пос­ле пастеризации и инкубации наблюдается выделение пу­зырьков газа из почвы, находящейся на дне пробирки с запахом масляной кислоты.

• 
  
  Симбиотическая. Наиболее известен симбиоз клубеньковых бактерий (сем. Rhizobiaceae) с бобовыми растениями. Обычно происходит корневое заражение, но известны растения, образующие клубеньки на стеблях и листьях.

Созданы бактериальные удобрения (например, нитрагин) для инокуляции (заражения) штаммами клубеньковых бактерий семян бобовых культур, что увеличивает их урожайность. Также для стимулирования процессов азотфиксации полезно вносить в почву небольшие «стартовые» дозы азотных удобрений, в то время как большие их дозы подавляют процесс.

Важное значение имеют симбиотические азотфиксаторы, живущие в клубеньках корней бобовых растений (клубеньковые бактерии), относящиеся к роду Rhizobium. Связывание азота атмосферы возможно только при симбиотической ассоциации микроорганизмов этого вида и высшего растения в основном из семейства Бобовые. Существует большое количество разновидностей (штаммов) клубеньковых бактерий, каждая из которых приспособлена к заражению одного или нескольких видов бобовых растений. Это отражается в их названиях: Rhizobium lupini — клубеньковые бактерии люпина и Rhizobium trifolii— клубеньковые бактерии клевера и т. д..

Корневые системы бобовых растений обладают специфическими корневыми выделениями. Благодаря этому клубеньковые бактерии скапливаются вокруг корневых волосков, которые при этом скручиваются. Такая способность организмов передвигаться в ответ на узнавание химических продуктов, называется хемотаксисом. В осуществлении контактного взаимодействия микроорганизмов С растением важное значение имеет так называемое лектину-глеводное узнавание растения микроорганизмом. Суть этого в том, что лектин корневых волосков растений прочно связывается с углеводом поверхности бактерий. Бактерии, внедрившиеся в корневой волосок, в виде сплошного тяжа (т. н. инфекционные нити), состоящего из соединенных слизью бесчисленных бактерий, проникают в паренхиму корня. Клетки перицикла начинают усиленно делиться. Возможно, бактерии выделяют гормональные вещества типа ауксина и именно это является причиной разрастания тканей, образуются вздутия — клубеньки. Клетки клубеньков заполняются быстро размножающимися бактериями, но остаются живыми и сохраняют крупные ядра. Бактерии при этом трансформируются сами, увеличиваются в размерах, поэтому их называют бактероиды.

Клубеньковые бактерии заражают только полиплоидные клетки корня. Ткань к пубеньков, заполненная бактериями, приобретает розовую окраску, так как поте заражения в клетках бактерий образуется пигмент, сходный с гемоглобином, — леггемоглобин. Этот пигмент связывает кислород воздуха и тем самым предохраняет фермент нитрогеназу от воздействия кислорода. Исследования показали прямую зависимость между содержанием леггемоглобина и скоростью фиксации азота. При отсутствии леггемоглобина азот не усваивается. Информация об образовании леггемоглобина содержится в ДНК ядра клетки высшего растения. Синтезируется клетками растения-хозяина. Однако он образуется после их заражения. Гены растений, кодирующие образование клубеньков, носят название nod-GENE (нодулин-гены). Показано, что скопление бактерий вокруг корня вызывает выделение веществ (возможно олигосахаров), которые активируют т. н. нодулин-белок, индуцирующий транскрипцию нодулин-генов. Взаимоотношения между высшими растениями и клубеньковыми бактериями обычно характеризуют как симбиоз. Однако на первых этапах заражения бактерии питаются целиком за счет высшего растения, т. е. практически паразитируют на нем. В этот период рост зараженных растений даже несколько тормозится. В дальнейшем азотфиксирующая способность бактерий увеличивается, и они начинают снабжать азотистыми веществами растение-хозяина, вместе с тем бактерии получают от высшего растения углеводы (симбиоз). По мере дальнейшего развития наступает этап, когда высшее растение паразитирует на клетках бактерий, потребляя все образующиеся там азотистые соединения. В этот период часто наблюдается растворение (лизис) бактериальных клеток.