Шпоры (Шпаргалки по биофизике), страница 5

В общем случае эффект действия ферментов обеспечивается эффектами:

1. сближения фермента и субстрата, что эквивалентно увеличению их концентрации.

2. ориентации участников реакции в пространстве друг относительно друга.

3. стабилизации промежуточного продукта реакции.

4. поляризации и перераспределения электронной плотности субстрата.

5. индуцированного соответствия фермента и субстрата.

33. Конформационные изменения в белке. Их значение для работы белка.

Конформационные изменения играют большую роль в функционировании белка. Это определяется, во-первых, индуцированным соответствием пространственной структуры: Изначально фермент находится в открытом состоянии, способном присоединять субстрат, соединение с субстратом вызывает конформационные изменения фермента и субстрата. Фермент переходит в закрытую форму. В закрытой форме фермент осуществляет катализ и под действием продуктов снова меняет конформацию на открытую и отщепляет продукты реакции.

Во-вторых, конформационные изменения могут играть роль для выполнения собственно рабочего действия белка или для перехода от одного режима действия к другому.

Примеры: K/Na-АТФаза, Воротный механизм ионных каналов, аллостерическая регуляция ферментов.

34. Внутримолекулярная динамика белка. Изменения конформации гемоглобина при оксигенации. Роль аллостерических регуляторов.

Каждая субъединица гемоглобина несёт одну группу гемма, расположенную между F и E спиралями глобина. Атом Fe образует 4 связи с атомами азота пиррольных колец, одну связь с гистидином и одну связь с O₂ или CO₂.

Функционально гемоглобин может находиться в двух конформационных состояниях:

Высокоспиновое:

d-электроны расположены таким образом, чтобы число неспаренных электронов было максимальным. Диаметр атома больше и выступает над плоскостью гема. Атом железа имеет 5 связей и способен присоединять кислород.

Низкоспиновое:

d-электроны расположены таким образом, что число неспаренных электронов минимально. Атом железа имеет меньший радиус и находится в плоскости гема. Железо имеет 6 связей.

Переход в низкоспиновое состояние происходит при присоединении кислорода, это приводит к уменьшению радиуса атома железа и втягиванию его в плоскость гема. Это перемещение вызывает изменение всей конформации полипептидной цепи глобина. Конформационные изменения одной субъединицы вызывают изменения других субъединиц. Это приводит к тому, что атом железа втягивается в плоскость гема до присоединения кислорода, что вызывает повышение сродства гема к кислороду. Таким образом, присоединение последних атомов кислорода к гемоглобину происходит легче. Таким образом происходит кооперативное взаимодействие субъединиц гемоглобина.

Аллостерическая регуляция происходит аналогичным образом. Присоединение регулятора к ферменту вызывает комплекс конформационных перестроек, что приводит к изменению функциональной активности фермента, его активации.

35. Прогнозирование и дизайн белковых структур.

Для расчёта пространственной структуры на основе АК последовательности используют два общих подхода:

• Гомологичное моделирование

Создаётся база шаблонов первичной структуры и их структурообразующих свойств. Сходства последовательностей достаточно для сходства пространственной структуры.

• Математическое моделирование

Производится расчёт структуры с минимальной свободной энергией или моделируется наиболее оптимальный процесс сворачивания структуры. Этот метод более точен, но требует намного больших вычислительных мощностей. Для него используются сети распределённого вычисления и суперкомпьютеры.

"Метод протягивания" заключается из предположения о том, что большинство вариантов третичной структуры уже известны. Производится перебор конформаций, расчёт их стабильности и выбор конформации с минимальной свободной энергией.

Направление белкового дизайна занимается моделированием белков с заданными свойствами. Главной проблемой этого направления является нестрогое соответствие между структурой и функциями белка. Существуют белки со схожей пространственной структурой, но выполняющие разную функцию, и наоборот.

Методы белкового дизайна подразделяются на: теоретические (основаны на знании соответствия между структурой и функциями АК последовательностей в реальных белках) и практические (основанные на методах точечных мутаций и синтеза искусственных белков).

37. Законы поглощения электромагнитного излучения веществом. Спектрофотометрия, её физические основы.

Спектрофотометрия – это область физики исследующая распределение электромагнитного излучения по длинам волн или частотам.

В наиболее общем случае все спектрофотометрические методы основаны на анализе интенсивностей света разной длины волны поглощенного веществом или прошедшего через него. Атомы и молекулы имеют дискретные энергетические уровни. Если на вещество падает ЭМ волна, то энергия, равная разнице энергии перехода между энергетическими уровнями может поглощаться. При этом происходит снижение интенсивности излучения. Этот переход осуществляется с разной вероятностью при разных длинах волн.

Интенсивность поглощения, по закону Бугера-Ламберта-Бэра: .

В этом соотношении интенсивность света, прошедшего через слой вещества экспоненциально зависит от толщины слоя и концентрации вещества.

Оптическая плотность вычисляется как десятичный логарифм отношения интенсивностей света до образца и после образца:

Измеряя оптическую плотность раствора при определённых длинах волн можно определить концентрацию поглотителя в растворе. Также возможно построение спектра поглощения в определённом диапазоне длин волн, затем этот спектр можно использовать при качественном анализе состояния системы, конформационные переходы и химические превращения часто отражаются на форме спектра поглощения.

Спектрофотометрические методы часто делятся по диапазону используемых длин волн. Область спектрофотометрии в видимом диапазоне длин волн называют колориметрией.

Спектральное положение линии определяется разницей энергии состояний, между которыми осуществляется переход. Здесь они расположены в порядке уменьшения энергии. Энергиям электронных переходов соответствуют области спектра высоких энергий и высокой частоты, спектр поглощения энергии на увеличение колебательного и вращательного движения расположен в области с низкими частотами и низкой энергией.

Ширина спектральных линий определяется естественным уширением по причине грубости фиксирующих приборов. Также большую роль играют взаимодействия с другими частицами, доплеровское смещение частот за счёт теплового движения и изменение спектров за счёт межмолекулярных взаимодействий.

38. Спектроскопические методы в биофизике. Их физические основы, задачи спектроскопии, классификация спектроскопических методов.

Спектроскопия – это область физики исследующая распределение электромагнитного излучения по длинам волн или частотам.

В наиболее общем случае все спектроскопические методы основаны на анализе интенсивности реакции вещества на воздействие определённой интенсивности и частоты. Этим воздействием могут являться ЭМ волны, магнитное поле, γ-лучи.

Атомы и молекулы имеют дискретные энергетические уровни. Если на вещество падает ЭМ волна, то энергия, равная разнице энергии перехода между энергетическими уровнями может поглощаться. При этом происходит снижение интенсивности излучения. Этот переход осуществляется с разной вероятностью при разных длинах волн.

Интенсивность поглощения, по закону Бугера-Ламберта-Бэра: .

В этом соотношении интенсивность света, прошедшего через слой вещества экспоненциально зависит от толщины слоя и концентрации вещества.

Эта зависимость используется в спектрофотометрических методах.

В качестве воздействия может использоваться переменное магнитное поле высокой частоты, которое поглощается ядрами или электронами в постоянном магнитном поле. На этом основаны методы ЯМР и ЭПР.

γ-лучи используются в методе мессбауэровской спектроскопии, так как они могут поглощаться тяжёлыми атомами металлов.

Свойства спектральной линии.

Интенсивность определяется количеством поглотителя в исследуемом объекте.

Спектральное положение линии определяется разницей энергии состояний, между которыми осуществляется переход.

Ширина спектральных линий определяется естественным уширением по причине грубости фиксирующих приборов. Также большую роль играют взаимодействия с другими частицами, доплеровское смещение частот за счёт теплового движения и изменение спектров за счёт межмолекулярных взаимодействий.

Методами спектроскопии возможно изучение химического состава объектов, количественный анализ, а также структурный анализ, так как изменение структуры вещества часто отражается на характере его спектра.

39. Метод электронного парамагнитного резонанса. Физические принципы и применение в изучении биополимеров.

Если внести частицу в определённым магнитным моментом в постоянное магнитное поле, то магнитный момент выстроится вдоль направления магнитного поля и будет прецессировать с частотой . Если теперь на частицу действовать слабым переменным магнитным полем, направленным перпендикулярно опорному полю, то при совпадении частоты переменного измерительного поля с частотой прецессии частицы, возникнет резонанс и сильное поглощение волны измерительного поля.

Электрон имеет спин ½, его энергетический уровень расщепляется на два, что соответствует переходу между спинами. В большинстве органических соединений спины электронов скомпенсированы и ЭПР не наблюдается. ЭПР наблюдается только у свободных радикалов и молекул с нечётным числом электронов, при этом, проявляются характеристические спектры, зависящие от электронного строения системы.

ЭПР используется при изучении реакций с участием свободных радикалов или белков, содержащих в качестве кофакторов атомы металлов с нескомпенсированным спином.

Также широко используется приём присоединения к исследуемым молекулам спиновых метоков и эффект Мессбауэра как анализатор.структуры атома, окружающих групп и характера цессии частицы, и частицы с чь слабым переменным магнитным полем, направленным перпендикулярно опорному полю, то при совпаде – свободных радикалов, содержащих неспаренный электрон. ЭПР спектр спин-метки зависит от её электронного окружения, конформации молекулы, к которой она присоединена.

40. Метод ядерного магнитного резонанса. Физические принципы и применение в изучении биополимеров.

Если внести частицу в определённым магнитным моментом в постоянное магнитное поле, то магнитный момент выстроится вдоль направления магнитного поля и будет прецессировать с частотой . Если теперь на частицу действовать слабым переменным магнитным полем, направленным перпендикулярно опорному полю, то при совпадении частоты переменного измерительного поля с частотой прецессии частицы, возникнет резонанс и сильное поглощение волны измерительного поля.

Ядерный спин имеют атомы, у которых нечётно хотя бы одно атомное число, массовое или порядковое. Ядерный спин равен нулю у и не равен нулю у

При включении магнитного поля для протона возникают два уровня, соответствующие параллельному и антипараллельному направлениям спина. Частоту переменного поля увеличивают до тех пор, пока она не достигнет некого предела, выше которого резонанс невозможен, а интенсивность поглощения записывают. В результате получается спектр поглощения, который подвергается анализу. Сигналы ядер атомов, входящих в определенные функциональные группы, лежат в строго определенных участках спектра, а интегральная площадь, ограниченная пиком, строго пропорциональна количеству резонирующих атомов. Таким образом, можно получить количественные и качественные характеристики образца.

Одни и те же ядра атомов в различных окружениях в молекуле показывают различные сигналы ЯМР. Отличие такого сигнала ЯМР от сигнала стандартного вещества позволяет определить так называемый химический сдвиг, который обусловлен химическим строением изучаемого вещества. В методиках ЯМР есть много возможностей определять химическое строение веществ, конформации молекул, эффекты взаимного влияния, внутримолекулярные превращения. Это позволяет определить структуру окружения атомов и структуру самого вещества.

Используют также приёмы обогащения образцов контрастирующими метками, наблюдения процессов включения метки в состав объекта. Важным свойством метода является возможность его использования на живых биологических объектах.

Существует два метода ЯМР: метод постоянного поля и импульсный метод.

Частным случаем применения ЯМР является метод томографии или ЯМР-интроскопии, применяемый в-основном в медицине.

41. Метод мессбауэровской спектроскопии. Его физические принципы и использование в изучении биополимеров.