Диссертация: Нейропротективные свойства белков Bcl-2 в мышиной модели с болезнью Альцгеймера.

Актуальность темы исследования. Термином нейродегенеративные заболевания (НДЗ) определяется большая группа нейропатологий, развивающихся у лиц преимущественно зрелого возраста, для которых характерно прогрессирующая гибель определенных групп нервных клеток, сопровождающаяся атрофией соответствующих отделов головного мозга. Болезнь Альцгеймера (БА) является одним из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний, возникающим преимущественно у людей пожилого возраста. При БА в первую очередь поражаются клетки гиппокампа, области мозга, ответственной за формирование и хранение памяти. В связи с этим, основным проявлением данного заболевания является прогрессирующая потеря памяти, со временем приводящая к слабоумию и полной потере способности к самообслуживанию. Из-за роста благосостояния населения и увеличения продолжительности жизни в развитых странах БА приобретает статус огромной социальной и экономической проблемы. В настоящее время не достигнуто полного понимания причин возникновения и развития БА, поэтому современные методы терапии лишь несколько смягчают симптомы, но пока не позволяют ни остановить, ни замедлить развитие заболевания. Лекарства, которые сейчас используются для лечения БА, способны только облегчить симптомы. В основном это препараты, восполняющие дефицит нейротрансмиттеров - ингибиторы ацетилхолинэстеразы. На основании доминирующей «амилоидной гипотезы» было разработано несколько стратегий, направленных на поиск терапевтических агентов для лечения БА. Соответственно, основной мишенью при разработке лекарственной терапии являлся бета-амилоид. Согласно проведенным клиническим испытаниям с 2002 по 2012 год только один препарат было официально одобрен к применению для лечения БА, Мемантин, который является антагонистом NMDA рецепторов глутамата [Morris, Clark et al. 2014]. В то время как стратегии антиамилоидной терапии до сих пор не были успешными у пациентов [Karran, Mercken et al. 2011], недавно разработанный Аducanumab, возможно, будет иметь больший успех [Sevigny, Chiao et al. 2016], однако на данный момент его эффективность вызывает большие споры в научном сообществе. В связи с этим, все больше ученых сходятся во мнении, что необходимо более детальное изучение физиологической и патологической роли бета-амилоида, а также поиск новых сигнальных путей, вовлечённых в патогенез БА и новых объектов потенциального терапевтического воздействия помимо β амилоида.
Степень разработанности темы исследования. Впервые о болезни Альцгеймера мир услышал 3 ноября 1906 года на 37-м съезде психиатров Юго-Западной Германии. Чуть позже в 1907 году вышла статья чешского психиатра и невропатолога Оскара Фишера, где описывается наличие бляшек и нейрофибриллярных клубков в 12 из 16 случаях старческого слабоумия [Fischer 1907]. 1976 году Роберт Катцман вывел, что старческая форма БА является, примерно, четвертой или пятой в списке причин смерти населения США, и предположил, что старческое слабоумие и болезнь Альцгеймера необходимо рассматривать как одно заболевание [Katzman 1976]. С развитием методов прижизненной визуализации головного мозга ученые получили более широкий спектр инструментов для исследования развития и причин возникновения болезни Альцгеймера. Так в 1980х годах были получены данные о раннем изменении гиппокампа у пациентов с БА [Ferris S. H. 1980, Frackowiak R. S. 1981, Mony J. De Leon 1989]. Благодаря этим открытиям, было выявлено что гиппокамп — это ключевое место патологии БА. В 1990 году при помощи метода конфокальной микросъемки была обнаружена корреляция между когнитивными функциями пациентов с БА и количеством синаптических контактов во взятых у них биопсиях мозга — чем сильнее выражены когнитивные нарушения у пациентов, тем большая потеря синаптических контактов между нейрональными клетками у них наблюдается [Dekosky ST 1990, Terry RD 1991 ]. Это открытие очень важно, так как именно оно позволило сделать вывод, что болезнь Альцгеймера — это не просто нейродегенеративное заболевание, при котором погибают нервные клетки головного мозга, а болезнь "синаптической потери". Это заключение дало толчок исследованиям развития БА в сторону изучения особенностей синаптических контактов, их образования и функционирования. В 1992 году нейробиолог Марк Маттсон показал, что в развитие БА вовлечен гомеостаз кальция [Mattson MP 1992]. Это открытие дало начало развитию самой молодой, но перспективной гипотезы патогенеза болезни Альцгеймера – «кальциевой гипотезе». К 2010 году накопилось много исследований, согласно которым дисрегуляция баланса кальция сопровождает развитие БА. Поэтому в современной нейробиологии появилось предположение, что именно нарушение кальциевого сигналинга может быть первопричиной, которая приводит к каскаду молекулярных нарушений в головном мозге, включая образование амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков. В 2009 году И. Б. Безпрозванный предложил, что одну из важнейших ролей в патогенезе нейродегенеративных заболеваний играют изменения в нейрональной Ca2+ сигнализации, которые также наблюдается при нормальном старении [Bezprozvanny 2009]. Нейрональный кальций является одним из важнейших вторичных посредников в нейронах, который принимает непосредственное участие в синаптической передаче. Нейроны очень чувствительны к внутриклеточному Ca2+ гомеостазу, поэтому даже самые малые аномалии в Са2+ сигнализации могут привести к разрушительным последствия в течение длительного периода времени. Нарушение механизмов кальциевого сигналинга является одним из самых ранних изменений на молекулярном уровне в этиологии БА. Было показано, что мутации в PSEN (белки пресенилины), ассоциированные с наследственной формой БА, опосредуют высвобождение кальция из эндоплазматического ретикулума (ЭР) либо непосредственно [Tu, Nelson et al. 2006, Supnet and Bezprozvanny 2011], либо путем модуляции кальциевых каналов ЭР [Kasri, Kocks et al. 2006, Wu, Yamaguchi et al. 2013, Shilling, Muller et al. 2014]. Одним из каналов, расположенных на мембране ЭР, является инозитол-1,4,5- трифосфатный рецептор (IP3R). Его функциональная активность повышается вследствие мутаций в PSEN [Shilling, Muller et al. 2014]. IP3R представляет собой внутриклеточный кальциевый канал, для которого существует три изоформы [Baker, Fan et al. 2017, Rossi and Taylor 2018]. Изоформа IP3R1 является изоформой, преимущественно экспрессирующeйся в головном мозге. IP3R1-опосредованное высвобождение кальция регулируется несколькими посттрансляционными модификациями, и было идентифицировано более 100 различных белковрегуляторов данного процесса [Prole and Taylor 2016]. Из-за его повсеместной экспрессии, IP3R1- опосредованное высвобождение кальция участвует во многих клеточных процессах, таких как выживание клеток, апоптоз, аутофагия и многие другие [Yamazaki, Fujii et al. 2012, Ivanova, Vervliet et al. 2014, Kania, Roest et al. 2017]. Важной частью этих процессов является «квазисинаптическая» передача кальциевого сигнала из ЭР в митохондрии посредством так называемых митохондриально-ассоциированных мембран ЭР (MAM), через IP3R на стороне ЭР и по потенциал-зависимому анионному каналу и митохондриальному кальциевому унипортеру на митохондриальной стороне [Szymanski, Janikiewicz et al. 2017]. Трансфер кальция в митохондрии необходим в особенности для поддержания механизмов синтеза АТФ и в целом для нормального функционирования клеток [Bravo, Vicencio et al. 2011, MacVicar, Mannack et al. 2015]. Как повышение, так и понижение IP3R-опосредованного трансфера кальция в митохондрии приводят к их дисфункции и индуцируют клеточную гибель [Decuypere, Bultynck et al. 2011]. Функциональная активность IP3R во многом определяется белками-регуляторами. В недавних исследованиях научная группа под руководством Г. Балтынка продемонстрировала, что IP3R является мишенью анти-апоптотических белков В-клеточной лимфомы 2 (Bcl-2), включая Bcl-2 и Bcl-XL [Rong, Bultynck et al. 2009, Monaco, Decrock et al. 2012]. Эти белки характеризуются четырьмя гомологичными доменами, причем третий (BH3) является ключевым для осуществления анти-апоптотической функции. Bcl-2/Bcl-XL посредством их гидрофобного кармана противодействует пермеабилизации наружной митохондриальной мембраны путем скаффолдинга и нейтрализации про-апоптотических членов семейства Bcl-2, белков Bax и Bak, предотвращая их олигомеризацию и образование пор [Davids and Letai 2012]. Научная группа Г. Балтынка и другие исследователи установили, что Bcl-2 связывается и ингибирует IP3R через его четвертый домен BH (BH4) [Rong, Bultynck et al. 2009, Monaco, Decrock et al. 2012]. Кроме того, белки семейства Bcl-2 также ассоциированы с БА. Гиперэкспрессия белка Bcl-2 в головном мозге на модели трансгенных мышей с БА замедляла прогрессирование когнитивных нарушений, в то время как образование внеклеточных бляшек уменьшалось [Rohn, Vyas et al. 2008]. Подводя итог вышеизложенному, можно заключить, что мутации в PSEN, ассоциированные с наследственной формой БА, влияют на внутриклеточную передачу кальций-зависимых сигналов, которые опосредуют эти дефекты. В этом проекте мы впервые исследуем, может ли Bcl-2 и/или его домен BH4 нормализовать чрезмерное IP3Rопосредованное высвобождение кальция из ЭР, вызванное мутациями, ассоциированными с наследственной формой БА.
Цели и задачи. Подтверждение гипотезы о том, что нормализация кальциевого выброса из ЭР через IP3R, осуществляемая через белок - регулятор апоптоза Bcl-2 (В-клеточной лимфомы2), может оказывать благоприятное воздействие на некоторые ранние патологические аспекты функционирования клеток, наблюдаемые при развитии БА, является целью данного исследования. Для достижения цели сформулированы и решены следующие научные задачи: 1. Проанализировать стабильность исследуемых белков семейства Bcl-2. 2. Подтвердить формирование белкового комплекса между белками Bcl-2 и каналами выброса кальция из эндоплазматического ретикулума in vivo на мышиной модели БА. 3. Выяснить, влияет ли Bcl-2-опосредованная регуляция кальциевого выброса из эндоплазматического ретикулума на морфологию синапсов. 4. Установить влияние Bcl-2-опосредованной регуляции кальциевого выброса из эндоплазматического ретикулума на накопление амилоидных бляшек в мышиной модели БА. 5. Разработать доступный качественный отечественный программный продукт для осуществления исследования с использованием «Водного лабиринта Морриса», апробировать его в лабораторных условиях и сравнить результаты с двумя из самых популярных коммерческих продуктов. 6. Выявить воздействие Bcl-2-опосредованной регуляции кальциевого выброса из эндоплазматического ретикулума в нейронах гиппокампа на когнитивные функции у мышей с патологией БА с использованием разработанного ПО.
Научная новизна. В рамках данного проекта впервые было рассмотрено в качестве терапевтической стратегии для лечения БА ингибирование IP3R-опосредованного чрезмерного выброса кальция из эндоплазматического ретикулума, вызываемого мутациями при наследственной форме БА. Для оценки нейропротекторных свойств в рамках данной терапевтической стратегии оценивались ранние признаки БА, которые, в свою очередь, могут влиять на более поздние аспекты течения заболевания. Интересным преимуществом использования Bcl-2 в качестве ингибитора IP3R-опосредованного высвобождения кальция является анти-апоптотические свойства белка Bcl-2 в качестве ингибитора про-апоптотических белков Bax и Bak, которые в значительной степени не зависят от функциональной активности IP3R. Таким образом, Bcl-2 может играть двойную роль, выступая, во-первых, в качестве ингибитора IP3R-опосредованного высвобождения кальция, и, во-вторых, в качестве ингибитора Bax/Bak-опосредованного апоптоза в клетках при развитии БА. Это первое исследование, посвященное способности Bcl-2 ингибировать избыточную передачу кальциевых сигналов, опосредованную IP3R, наблюдаемую при патогенезе БА.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты, полученные в данной работе, о молекулярных механизмах нейрональных клеток обладают высокой научной значимостью для понимания фундаментальных вопросов современной нейробиологии, таких как исследования кальциевой регуляции, стабильности синаптических контактов, механизмов формирования памяти и нарушений, наблюдаемых при болезни Альцгеймера. Полученные данные свидетельствуют о том, что нарушения гомеостаза кальция могут являться первопричиной развития симптомов БА. Практическая значимость результатов исследования заключается в обнаружении возможной мишени для развития терапевтических подходов для лечения и/или замедления развития БА. Рассмотрен новый молекулярный путь, который может также стать ключевым в разработке терапии БА. Данные работы дают основание предположить, что сверхэкспрессия Bcl-2 имеет множественные нейропротекторные эффекты в моделях БА, которые могут выходить далеко за рамки его канонических анти-апоптотических эффектов. Воздействуя на внутриклеточные каналы высвобождения Ca2+, BH4 домен Bcl-2 белка может ингибировать избыточное IP3R/RyR-опосредованное высвобождение кальция из ЭР. Эти результаты позволяют предположить, что анти-апоптотические домены Bcl-2 и производные белковые домены, такие как домен BH4, могут иметь терапевтический потенциал для предотвращения начала БА и задержки нейродегенерации. Кроме того, значимость результатов работы выходит за рамки понимания механизмов патологии болезни Альцгеймера – обнаруженный молекулярный путь имеет важное значение для других нейродегенеративных заболеваний, в который происходит нарушение кальциевого гомеостаза, для понимания общих процессов старения и формирования памяти и работы сигнальных механизмов нейрональных клеток. Важное практическое значение имеет разработанный в данном исследовании программный продукт Minopontikos. Программа позволяет быстро и качественно обрабатывать данные эксперимента «Водный лабиринт Морриса», выдавая такие параметры, как латентное время поиска, время и процентное время в квадрантах интереса, длина пройденного пути, ошибка углового направления, средняя близость к платформе (или Близость Галлахера, индекс обучения) и число пересечений зоны интереса. Кроме того, одним из выходных файлов является сводная таблица параметров X-Y-T, где X и Y – это координаты местоположения испытуемого животного, T – время, поэтому при необходимости все дополнительные функции положениявремени (а все параметры трассировки объекта являются данными функциями) пользователь может вывести или проверить самостоятельно. Разработанное программное обеспечение Minopontikos имеет вид полноценной автономной и самостоятельной программы, не требующей установки дополнительного ПО или плагинов. Это обеспечивает ее свободное использование другими исследователями по всему миру.