Для студентов МГТУ им. Н.Э.Баумана по предмету Основы взаимодействия физических полей с биологическими объектамиЛабораторные работыЛабораторные работы 2017-12-28СтудИзба

Лабораторная работа: Лабораторные работы

Описание

Описание файла отсутствует

Характеристики лабораторной работы

Список файлов

Прочти меня

Файл скачан с сайта StudIzba.com

При публикации файла на другом ресурсе, активная гиперссылка на studizba.com обязательна

сканирование0001

Распознанный текст из изображения:

УДК 577.3

ББК 28.071

Ж 35

Рецензенты: А.Д Приезжее, ГИ. Семикин

Жаров В.П., Жорина Л.Во Змиевской Г.Н.

Изучение фотодинамического действия света на клеточные структуры. Методические указания к выполнению лабораторной работы по курсу «Основы взаимодействия физических полей с биообьектами» у' Пол ред.

И.Н. Спиридонова. — Мд Изд-во МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2004. — 28 сд ил.

!БА 5-7038-2512-1

Изложены основнъм положении теории фогодннамического

эффекта, описаны харахтерные особенности применяемых в клинической практике отечественных фотосенсибилизаторов (фетогем, фотосенс). Рассмотрена методика определения доз облумния при фотодннамическом воздействии на кровь.

Лвя студентов бномеднцинских и биотехнических специальностей.

Их 9 Бкехнаш 6назз

УДК 577.3

ББК 28.071

Владимир Павлович Жаров

Лариса Валерьевна Жорииа

Григорий Николаевич Змиевской

Изучение фотодииамвческого действия света

иа клеточные структуры

Методические указания

Редактор ЦМ Коро еаа

Корректор Г С Венееа

Ксмеыст рн х в р тка ВВ Земское

П ден но в печать 2З 07 03 Формат 60х84716. Бумага сфсее3ая.

Печ х 1,75 У х. е ч х 1,63. Уч -нзд х 1,45 Ткрек 50 экз

И д Н 139.Заказ №

Издательство МГТУ нм Н Э. Б унана

105005,москва, 2-я Бауманская, 5

О МГТУ не Н Э Баум нк, 2004

1ЗБХ 5-7033-2512-1

ВВЕДЕНИЕ

Лазерная фотодинамическая терапия — наиболее современный и наименее травматичный метоп лечения онкологических заболеваний

Суть метода состоит в избиратевьном воздействии лазерного излучения на патологические клетки, предварительно активированные ввелением специального вещества — фотосенсибилизатора (ФС).

ФС должен обладать рядом специфических свойств, характеризующих его эффективность. Главные из них: селективное накопление в патологических клетках; избирательное и достаточно высокое поглощение излучения на рабочей длине волны лазера; способность с максимальной эффективностью передавать поглощенную энергию вну1риклеточному кислороду и тем самым запускать фотохимические реакции, приводяшие к гибели патологических клеток при минимальном воздействии на нормальные клетки.

В качестве ФС могут выступать естественные (эпдогенные) вещества, участвуюшие в метаболизме клеток (хлорофилл, порфирин). На их основе разрабатаны лечебные препараты порфириноваго ряда, так называемые производные гематопорфирина (ПГП): фотофрин (США, Канада), фотосан (Германия и другие страны Европы), фатогем (Россия). Исходным веществам для изготовления этих препаратов является кровь. В настоящее время в зарубежной практике разрешены к ггрименению только эти препараты, а в России, кроме того, разрешен к ограниченному применению и синтетический препарат фотеселс, представляюший собой металлопорфириновый комплекс с участием цинка или алюминия (относящийся к группе фталоцианинов).

Механизм ФДТ еше не изучен до уровня повседневных методических рекомендаций, поэтому каждый медицинский центр, где применяется ФДТ, является одновременно и научным центром. Идет непрерывный поиск и исследование новых, более эффективных, ФС и постоянное совершенствование технических средств (лазерные источники, средства доставки излучения к объекту, средства дозиметрического контроля процесса и управляюшие устройства). Возможности метода не о1раничиваются онкологией Имеются интересные сообщения о применениях ФДТ в кардиологии, микробиологии, дерматологии и ряде других областей.

сканирование00010

Распознанный текст из изображения:

Плоское строение позволяет молекулам ГП-1Х при высоких концентрациях образовывать агрегаты в виде «столбиков монет», Эта агрегация приводит к смещению максимумов в спектре поглашения, к тушению флуоресценции препарата ГП-1Х н не лает возможности использовать его для диагностики, а также снижает его эффективность при фотодинамическом воздействии 1ФДВ) Это говорит о важности применения правильной конпентрации ГП-1Х для ФДТ. Кроме того, преимущественное накопление ГП-1Х в опухолях неизбежно приведет к агрегации ФС. Таким образом, с этой точки зрения ГП-1Х не является «идеальным» ФС для ФДТ.

Агрегировать в виде «столбика монет» А)ФцБ4 мешает атом А1, который выходит из плоскости макроцнкла, поэтому агрегаты А1ФцБ4 образуются соединением молекул в одной плоскости Агрегация А1ФцБ4 также приводит к тушению его флуоресденцин, однако при большей концентрации, чем у ГП-1Х.

По своим растворимым свойствам ГП-!Х гидрофобен, т. е. практически нерастворим в воде и обладает большим сродством к липидам. Поэтому ГП-1Х при накоплении локализуется в мембранах клетки и внутриклеточных органелл.

ФС А1ФцБ4 гидрофилен, т. е. при накоплении в клетке ан должен локализоваться в водной фазе: цитоплазме, лизосомах н других органеллах Однако накопле4гие этого ФС в клетках происходит значительно медленнее, чем накопление препарата ГП1Х, так как мембрана клетки н внутриклеточных органелл— существенная гц4еграда для липофобного А1ФцБ4. Кроме того, молекула липофобного А)ФцБ4, так же как и ГП-1Х, является достаточно большой и не может проникнуп, в клетку путем простой диффузии.

Поскольку ГП-!Х накапливается в мембранах и трудно переходит в водную фазу, он очень медленно выводится из организма. Гидрофильные же свойства А)ФцБ4 позволяют ему быстро выводиться из организма, что является его очевидным преимушеством перед ГП-1Х.

3. ВЫБОР ДЛИНЫ ВОЛНЫ ИЗЛУЧЕНИЯ ПРИ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

Идеальным является случай, при котором максимум поглощения ФС совпадает с максимумом спектрзльной плотности

источника света. К сожалению, это на практике удается реалн-

зовать далеко не всегда (даже если )п И!го желаемое совпадение достигнуто, введение препарата )п яш, как правило, изменяет положение максимума поглощения ФС малопредсказуемым образом). Поэтому используется либо перестраиваемый в широком диапазоне лазер 1на красителе), либо мощный широкополосный источник (кварц-галогенная или ртутная лампа). В последнее время большой интерес вызывают источники на светодиодах, монохроматичность которых значительно выше, чем для ламп, хотя и гораздо ниже, чем для лазеров.

На рис. 5 представлены характерные спектры поглощения для растворов препаратов фотогема и фотосенса в сопоставимых концентрациях.

Видно, что наиболее изученные и широко примеьшемые в медицинской практике препараты на основе ПГП обладают далекими от оптимальных спектральными характеристиками. В самом деле, самый интенсивный пик поглощения препарата фотогема расположен в районе 400 нм, т. е. там, где мягкие биоткани, ввиду нх существенной кровонаполненности, очень плохо пропускают электромагнитное излучение. Характерная глубина проникновения здесь не превышает 1 мм, что не позволяет проводить ФДТ для имеющих практическое значение слоев биоткани. Самый же длинноволновый пик поглощенна, расположенный в области достаточно высокой прозрачности биотканей (625...630 нм), является настолько слабым, что требует высоких уровней интенсивности облучения !пороговое значение потока составляет около 50 мВтгсмт, что требует обеспечить выходную мощность лазера порядка 0,5...1 Вт), а также больших концентраций препарата, что может оказаться нереализуемым ввиду его достаточно высокой токсичности. Это заметно сужает сферу практических применений препаратов порфириновой группы.

Препарат фотосенс имеет основной (самьгй интенсивный) пик поглощения в районе 660...670 нм. Это позволяет снизить пороговую плотность потока излучения примерно на порядок по сравнению с препаратом фотогемом. Тем самым открывается возможность проведения эффективной ФДТ с применением светодиодных источников, поскольку в этом диапазоне спектра имеются интенсивные облучатели данного типа (см. рнс. 5)

Типичное значение выходной мощности светодиода на основе СаА1сззАз (МГДС-структура) составляет 1 мВт в непрерывном режиме при токе через р-и-переход 10 мА, при этом ширина спектра излучения прн максимуме в районе 660 4 10 нм

сканирование0002

Распознанный текст из изображения:

Цель работы — ознакомление с современным методом лечения злокачественных опухолей и других трудноизлечимых заболеваний — с методом фотодинамической терапии (ФДТ) — на примере наблюдения фотодинамического эффекта (ФДЭ) на взвеси эритроцитов.

1. КРАТКИЕ СВЕДЕНИЯ ИЗ ТЕОРИИ

Основным процессом, ответственным за фотодинамический эффект (ФДЭ), можно считать передачу энергии возбуждения от ФС к внугриклеточному кислороду (рис. 1). Ряс. 1. Схема передачи энергии возбуждения

от ФС к синглетяому кислороду

При поглощении кванта света йч молекула ФС переходит из основного Юс в возбужденное о'состояние. Оба эти состояния синглетны, т. е. спины внешних электронов в молекуле ФС анти- параллельны, и суммарный спин равен нулю, а спиновое число 5 = 1 (о = 2з +1, где з — суммарный спин). Переход 4~ — ьо вследствие этого наиболее вероятен. Ближайшее к о' возбужденное состояние, расположенное чуть ниже, является триплетным (спины внешних электронов параллельны, з = 1 и о = 2з+1 = 3) Оно не может непосредственно заселяться из основного состояния 5с, поскольку действует правило отбора по спину (переход ое — ь Т' примерно в 10Е..106 раз менее вероятен, чем Ьс -э 5') Но ввиду малой разницы энергий состояний 5' и Т' возможен переход молекулы ФС из состояния о' в состояние 7" за счет

спин-орбитального взаимодействия, смешивающего состояния с различной спинозой мультиплетностью. Можно найти ряд ФС, у которых вероятность перехода Г, из состояния о в триплетное состояние Т', назьгваемого интеркомбинаяионаой холаерсией, близка к единице (у, > 0,8). Поскольку из-за тех же правил отбора излучательный переход Т' — ь ос запрещен, время жизни триплотного состояния Т'много больше (г -10-'.. 10 4 с), чем время

и

жизни синглетного возбужденного состояния ю'(г . -10 а...)0 ус),

5

т. е. происходит аккумуляция молекул ФС в триплетном состоянии Т'. Аккумуляшш не могла бы происходить, если бы отсутствовала интерконверсия, и вся поглощенная энергия высвечивалась бы обратно в виде флуоресценции о"* — э Юе (время жизни состояния о*относительно перехода 5 — ь ос -~- йчел составляет

- 10-з...10-З с). Некоторый очень слабый фон флуоресценции всегда присутствует (у„х < 1) и может быль зарегистрирован достаточно чувствительными приемниками излучения. Особенность ФС для ФДТ вЂ” преимущественное его накопление в опухолевых клетках, поэтому повышение интенсивности флуоресценции по сравнению с фоном, характерным для нормальных клеток, является признаком патологии и составляет основу метода люминесцентной диагностики, часто предшествующей ФДТ. Отметим, что требования к ФС, определяющие его эффективность для терапии и диагностики, противополохсны. Для диагностики необходимо, чтобы у „э О, для терапии, наоборот, уах — ь 1.

Аккумуляция ФС в триплетном состоянии Т' делает возможной эффективную передачу энергии возбуждения друпгм молекулам с образованием свободных радикалов. В данном случае наиболее вероятна передача энергии возбуждения молекуле кислорода. Основное состояние молекулы кислорода О является триплетным, тогда как ближайшие возбужденные состояния синглетны ('Оз). Наиболее устойчивым из них является синг- летное состояние 'Ь, отстоящее от основного на — 0,976 эВ (х = 1,27 мкм). Ввиду различной мультиплетности синглетного состояния 'Ьг и основного триплетного состояния Оз возможна аккумуляция молекул кислорода в состоянии 'Ь

Характерное время жизни синглетного состояния 'Ь кислорода ('Оз ) в жидкой среде сильно зависит от типа среды н может

сканирование00020

Распознанный текст из изображения:

У71

ц

12

не превышает бО нм (на уровне 0,5). При угловой ширине пучка излучения (на уровне 0,5) 50 ь 10С это дает силу саста порядка 5 мКд. Достиукение плотности потока порядка 1О мВт/смт впаяне возможно при матричном исполнении светодиодного облучателя и применении оптической системы, собирающей выходной пучок в пятно диаметром порядка 1 см.

Применение препарата фотосенса на практике уже показала, что с его помощью можно успешно лечить такие заболевания, которые ранее не считались доступными для ФДТ. Прежде всего эта заболевания желудочно-кишечного тракта, урологические, гинекологические. Имеются весьма обнадеживающие результаты в лечении рака молочной железы, предстательной железы и даже печени, при котором препараты на основе ПГП совершенно не эффективны. Однако, поскольку фотосенс применяется пока относительно недолго, настоящая оценка его эффективности еще впереди. Механизм его действия, заметно отличный от препарата фотогема, изучен еще совершенна недостаточно. Это, с одной стороны, заставляет проявлять известную осторожность при рекомендациях, с другой стороны, в процессе исследований открываются новые воэможности использования препарата. В частности, он оказывается эффективньум средством против особо стойких бактерий и вирусов, которые не поддаются даже самым сильным антибиотикам. Этот обозначает новые горизонты как в лечении традиционных тяжелых инфекционных заболеваний, так и в поисках методов лечения СПИДа.

Учитывая достижения лазерной техники, волоконной оптики, информатики и вычислительной техники, можно построить блоксхему современной установки для ФДТ, реализуемой в комплексном оснащении специализированных кабинетов (рис. 6).

Рпс. б. Блок-схема современной установки для ФДТ 7 — пммьпт, У вЂ” арач оператор; 5 — ЭВЫ, 4 — ппфро-ьпьлогоныи ппьабрььовачеьа, 5 — р,б — ур р,у — пу — пп кпчуапьпы аппаратура, 9 — спсммь упрььльпш апаеекопьрольпоп ьппьрьчурой

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ

ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА

Прн выборе модели для лабораторнога исследования ФДЭ внимание в первую очередь привлекает кровь. В самом деле, гемоглобин — белок, ответственный за транспорт кислорода от легких ко всем клеткам и тканям организма — сосредоточен в эритроцитах — главной составной части крови. В 1 ммз крови содержится — 5 10б эритроцитов, их суммарный объем превышает объем следующих за ними по присутствию в крови телец (лейкоцитов и тромбоцитов) примерно в 50 раз. Эритроцит представляет собой дискоцит (тор без отверстия) со средним диаметром - 8 мкм, наименьшей толщиной (в центре) — 0,9...1 мкм и толщиной тора — 1,7.. 2,4 мкм (рис. 7). Отметим, однако, что геометрия дискоцита присуща эритроциту только в изотаническом растворе (рис. 7, а). Поскольку эритроцит пе содержит ядра и его свойства определяются внешней мембраной, форма, а следовательно, и соотношение меукду объемом и внешней поверхностью эритроцита существенно зависят от осмотического давления (рис. 7, б, в).

Таким образом, осмотическое давление является параметром, определяющим ход транспорта газов через клетки и ткани, а вместе с ним — и весь метаболизм клетки. Но присутствие ФС влияет как раз на мембранный транспорт, т. е. управляет осмотическим давлением Одновременно ФС окисляет гемоглобин, поскалысу ключевым процессом для ФДТ является генерация и последующее химическое тушение синглетного кислорода. Таким образом, именно эритроциты первыми «принимают на себяь воздействие ФС.

Под действием ФС происходит сначала изменение геометрии эритроцитов, затем их гемолиз — разрыв мембраны и гибель эритроцита как организованной формы кровяных телец. При этом ввиду преобладания эритроцитов среди других элементов крови оптические, механические и прочие свойства крови определяются в основном эритроцитами. Следовательно,при гемолизе следует ожидать радикального изменения оптических свойств крови (поглощения, рассеяния), выражающегося в изменении экстинкции среды Этот факт, давно известный биологам, и закладывается в основу лабораторного моделирования ФДЭ.

С оптической точки зрения, кровь представляет собой суспензию (взвесь) эритроцитов в практически прозрачной среде. Уже изменение формы эритрацита приводит к слабому, но

сканирование0003

Распознанный текст из изображения:

меняться в пределах 1...10 З с. При наличии в среде возбужденных молекул ФС в триплетном состоянии Т*, энерпш которого близка к энергии синглетного состояния 'Ьз, весьма вероятно перекрытие электронных оболочек молекул ФС и кислорода с резонансным заселением синглетного состояния 'Ь кислорода Этот процесс можно схематически изобразить в виде [см рис. 1):

Т'[Т[[Т[ + зО [Ц[ф] — э бе[Ц[Т[ ч 'О' [Т[[Ц,

т е электрон с возбужденной орбитали ФС переходит на возбужденную эрбиль 'Л кислорода, а с самой низкой [основной) орбитали кислорода электрон переходит на вакансию в основном состоянии ФС.

Синглетный кислород 'Оз более активен при взаимодействии с внугриклеточными веществами, чем кислород в основном состоянии Оз. При этом возможен как физический механизм передачи возбуждения, по типу передачи энергии от ФС к самому кислороду без изменения химического состава, так и химический, при котором кислород вступает в реакцию с соответствующим веществом. Поскольку в обоих случаях не происходит радиационных переходов, вещества, принимающие энергию возбуждения от синглетного кислорода, называются тушителями. Вещества-тушители всегда присутствуют в клетках и межклеточной среде, нейтрализуя избыточный синглетный кислород. Преобладание физического механизма тушения означает отсутствие ФДЭ. Это имеет место в отсутствие ФС, когда синг- летный кислород образуется под влиянием естественных факторов [например, при повышенном солнечном облучении). Для реализации же ФДЭ необхолимо включение химического механизма тушения, при котором в реакцию с возбужденным состоянием 'От вступают ненасыщенные соединения, входящие в состав белков и липидов. Итак, требуемый ФДЭ можно схематически изобразить в виде цепочки реакций

5, +ля — -'-' — ьо — ' — "" — ~Т;

[1)

Т + 'О, эб, + 'О„' 'Оз ь КН, э К.

Здесь ос — невозбужденное синглетное состояние ФС, о— эффективное сечение поглощения света молекулой ФС; Тс — интенсивность падающего излучения, Вт/смз; Б — возбужденное синглетное состояние ФС; Т' — возбужденное триплетное состоя-

ние ФС; у — квантовый выход интерконверсии, От — невозбужденное (триплетное) состояние молекулы кислорода; Π— возбужденное синглетное состояние молекулы кислорода; ВНх — химический тушитель [субстрат), т. е. внутриклеточнае вещество, либо входящее в состав мембран или межкяеточной среды вещество, активно взаимодействующее с синглетным кислородом и Лающее окисленный продукт рэ непосредственно воздействующий на метаболизм клетки с летюъным для нее исходам.

ФДЭ можно ослабить или усилить в присутствии веществ, либо сильно взаимодействующих с синглетным кислородом и тем самым ослабляющих его реакцию с субстратом [ингибиторы), либо нейтрализуюших действие физических тушителей, увеличивающих концентрацию субстрата, влияющих на мембранный транспорт [проаксиданты). Наиболее вероятная схема таких процессов приведена на рис. 2.

а«гтавамэ и * аотшеншэр р

Рис. 2. Схема процессов, приводящих к гибели клетки за счет ФДЭ

сканирование00030

Распознанный текст из изображения:

6 7 8 9

!5

«11!

вполне регистрируемому изменению спектра пропускання суспензии, поскольку рассеяние при сферуляции эритроцитов возрастает, а поглощение падает.

Рис. 7. Геометрия эрнтроцита в различных условиях

— в изотоническом рвюворе; 6 — при а и тическом д вл нии 2!7 моем)л,

е — при асмотическом давлении 1зо моемул

Суммарная экстинкция оказывается минимальной при полной сферуляции эритроцитов. Полная же гемолизация крови приводит к резкому падению оптической плотности, причем количественное описание этого эффекта на сегодня в литературе отсутствует

Если, например, предположить, что при разрыве мембраны все молекулы гемоглобина оказываются в растворен рассеивают

свет как рэлеевские частицы (средний размер молекулы гемоглобина 11 11 7 нм, т е наибольший поперечник молекулы мал па сравнению с длиной волны света), то такого резкого падения оптической плотности, которое наблюдается в эксперименте, расчет не дает. Ряд пшотез, выдвигавшихся для обьяснения этого эффекта, еще ждет своего экспериментального подтверждения. Та, что в результате ФДЭ кровь из классической мутной среды (суспензия с большим рассеянием и поглощением) превращается в раствор, близкий к коллонднаму, может быть взято за основу экспериментальной методики.

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

И МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ

Для выполнения лабораторной работы используется следующее оборудование (рис. 8) и материалы:

Рис. 8. Схема экспериментальной установки дла наблюдения

ФДЭ на взвеси эритроцитов

1 — источник света; 2 — «анл н ор; 3, 6,  — ди фретмм; 4 — коллим тор,

5 — сменные интерференпионные фильтры, 7 — кювета с исследуемой жидко-

стью, Р— св год лительнел пластинка, 10 — фотодиод, 11 — фотоэлемент,

12 — усилитель постоянного тока, 13 — измерит льныи прибор

колориметр фотоэлектрический КФК-2;

источники света. осветитель эндоскопический ОС-150 со световодным кабелем; светодиодная матрица с набором светодиодов, излучающих в красной области спектра; коллимированный источник света на базе лампы накютивания, применяемый в микроскопии и для экспериментов на оптической скамье,

сканирование0004

Распознанный текст из изображения:

502 2. ХАРАКТЕРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИЗУЧАЕМЫХ В РАБОТЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ

5Ок

ооон

СН,

СН, Н

2

СООН

СН,

Сн,

С. С .С

НС С С С С СН 2 г 5 г 5 в

С вЂ” й й — С

ф Н

Н вЂ” С С вЂ” Н

Н 5'

Н С=й й — С

1 5 5 З

НΠ— С вЂ” С С С С вЂ” СН,

СН

СН, Н Н вЂ” С вЂ” СН

в

ОН

Рас. 3. Струхтурная формула молекулы гемагопорфирина 1Х

Опирзясь на данные исследований и практического использования ФДТ, можно в общих чертах сформулировать требования к «идеальному> ФС. Он должен:

иметь доступный способ получения и обладать постоянным химическим составом;

быль устойчивым при хранении и введении в организм, обладать низкой токсичностью;

иметь высокую селективность накопления в патологических тканях и сравнительно быстро выводиться из организма;

слабо накапливазъся в коже;

иметь высокий квантовый выход у„триплетного состояния; иметь возможно более интенсивный максимум в спектре поглощения в области 800...900 нм (область наибольшей прозрачности мягких тканей).

В работе изучаются два вида ФС. Отечественный препарат фотогем, разрешенный к клиническому применению, является ПГП Одна из форм гематопорфирина — так называемый гематопорфнрин-1Х (ГП-1Х) — является продуктом распзда гемоглобина после завершения кислородного обмена в капиллярах организма. Структурная формула ГП-1Х показана на рис 3. Еще один изучаемый отечественный препарат фотосенс по структуре близок к металлокомплексу фталоцианина с участием алюминия (А1Фц84), структурная формула которого показана на рис. 4.

Рлс. 4. Структурная формула А1фц84

Как можно заметить, основой химической структуры обоих ФС является цорфириновый цикл, состоящий из четырех пиррольных колец. Молекулы имеют плоское строение, что связано с сильным я-элекгронным взаимодействием по макрокольпу. Система сопряженных двойных связей в молекуле А1ФцБ4 длиннее, чем в молекуле ГП-1Х, т. е. у А1Фц84 сильнее делокализованы по молекуле л-электроны. Поэтому у А1Фц84 при большей длине волны Х располагается самый длинноволновый максимум поглощения (рис. 5). 500 00 ° ва и.. м 50 2 50 ва 20 ' 50

550 00 50 ОЮ 550 500 550 вм 550 Х, ЛМ Рис. 5. Характерные спектры поглощения препаратов фотогема (2)

и фотосенса (3), характерная глубина лроииювовения электромагнитного излучения (усредненная) в мягкие биоткани (1)

и характерная спектральная плогносп излучения светодиода на ОаА1Аз (4). Масштаб измерения длл глубины проникновения 10-' мм,

лла остальных кривых — оглосигельные единицы з %

сканирование00040

Распознанный текст из изображения:

люксметр (любой из выпускаемых промышленно, имеющий диапазон измерения освещенностей до 105 лк);

микроскоп лабораторный с увеличением порядка 400...500 , (безыммерсионный);

штатив для установки образцов в процессе облучения или оптический столик из комплекта оптической скамьи;

прямоугольные кюветы, пробирки, пипетки, протирочный материал (тонкая ткань, вата), спирт;

физиологический раствор;

фотосенсибилизаторы (фотогем, фотосенс);

ингибитор: гипосульфит (тиосульфат) натрия, в кристаллах; образцы крови (предлагаются преподавателем для исследования на основании лабораторных анализов поликлиники);

дистиллированная вода.

Примечание. Для исследования преподавателем может быть предложен новый тип ФС или ингибитора, а также различные образцы крови.

Экстинкция суспензии эритроцитов измеряется на фотоколориметре (приборе, измеряющем оптическую плотность на различных длинах волн). Используемый в лабораторной работе колориметр КФК-2 позволяет провести измерения на 9 длинах волн от 315 до 750 нм. Это дает возможность, хотя и грубо, но построить кривую спектра пропускания исследуемых жидких препаратов. Пропускание Т определяется отношением прошедшего через образец потока излучения Х к падающему потоку Хо, приведенными к одному и тому же поперечному сечению

Т= —.

Х

(2)

Для корректности определения Т оптическая схема колориметра КФК-2 содержит коллиматор и диафрагмы, обеспечивающие квазипараллельность проходящего через образец пучка излучения. Поскольку как спектральная интенсивность источника, так и спектральная чувствительность приемника зависят от длины волны, в колориметре КФК-2 используется калибровочный канал, в который помещается кювета, заполненная растворителем (в данном случае, физраствором, оптическая плотность которого в рассматриваемом интервале длин волн мало отличается от водяной).

Измерение Т на каждой длине волны проводится следующим образом: сначала в луч вводится калибровочная кювета и с помощью регулировки чувствительности приемного канала по-

16

казания колориметра КФК-2 устанавливаются на Т = 1 (шкала отградуирована в процентах).

После этого колориметр КФК-2 переключается на измерительный канал (калибровочная кювета выводится из луча и точно на ее место помещается измерительная кювета с испытуемой жидкостью).

При правильной калибровке (100 % пропускания при открытом окне фотоприемника и 0 % при закрытом) показания колориметра дают значение искомого пропускания. Против шкалы пропускания (равномерная — от 0 до 100 %) нанесена шкала оптических плотностей Д (логарифмическая),

(3)

Д = — 1д Т.

17

Величина Д меняется в пределах от 0 (Т = 1) до 0 (Т = 0), однако фактическая возможность измерения Д определяется ценой деления шкалы. Так, при Т = 0,1 Д = 1; а при Т = 0,01 Д = 2. Проводить измерения с точностью, превышающей 1 % по Т, нереально, причем при малых пропусканиях (Т < 10 %) ошибка резко возрастает. Поэтому реальным диапазоном измерения Д является 0 < Д < 2. По этой причине фактическая возможность абсолютного измерения концентрации исследуемого вещества по оптической плотности, в соответствии с формулой Ламберта — Бера затруднена

Д =свХ,, (4) где с — концентрация; а — коэффициент молярной экстинкции; Х вЂ” толщина образца (длина оптического пути излучения в испытуемой среде).

Х

Относительная концентрация выживших частиц — в зави-

ХО

симости от времени облучения ~ и дозы облучения Х), имеющей смысл суммарной падающей на исследуемый пул клеток энергии излучения, может быть найдена на основе предложенной в МГУ им. М.В. Ломоносова ~11 и развитой в МГТУ им. Н.Э. Баумана математической модели (см. приложение). Простейший вариант этой модели базируется на предположениях о пренебрежении репаративными процессами, преобладании химического механизма тушения, отсутствии кислородного голодания и определении доли выживших клеток сразу после прекращения облучения. Результатом расчета при таких предположениях будет следующая зависимость относительной концентрации от дозы:

сканирование00050

Распознанный текст из изображения:

Х 1 з

1и = — — а9г.

Х 2 е

с

(5)

-сз

-0,2

-о,з

— сд

Здесь бг = 2) — доза воздействующего излучения, а, — постоянная, характеризующая скорость гибели сенсибилизированных клеток в начальный момент облучения.

Найденная зависимость (5), будучи построенной в координа-

Х

тах (1в —; г), и называется дозоаой кривой. Коэффициент а

Х,*

а характеризует крутизну этой кривой (см. приложение) В виде дозовой кривой можно представить и экспериментальные данные.

Пример дозовой кривой приведен на рис 9 Поскольку в дозовую кривую (5), определяющую зависимость 1п — от дозы

Х

Х,

облучения, входит не абсолютная концентрация сенсибилизированных частиц, а относительная, приводить в соответствие измеряемую оптическую плотность Д с абсолютной молярнай концентрацией с нет необходимости, тем более, что коэффициент молярной экстинкции а априори неизвестен.

з

Т = 20 ..30 %, чтобы диапазон изменения пропускания при гемолизе эритроцитов был велик по сравнению с исходной величиной пропускания,

б) выбором концентрации ФС, достаточно большой для обеспечения полного поражения всех эритроцитов в образце,но при этом достаточно малой лдя того, чтобы исходное пропускание образца с добавленным ФС не сильно отличалось от несенсибилизированного (т. е находилось в пределах тех же 20...30 %);

в) обязательным измерением характеристик контрольного образца, вьщерживаемаго параллельно с облучаемым в темноте с тем, чтобы вьп(слать при каждом измерении ту оптическую плотносчь, которая определяется именно ФДЭ, а не всеми прочими причинами.

Основной серии измерений, позволяющих построить дозовую кривую, должны предшествовать 2 серии предварительных измерений:

а) спектральной характеристики пропускания суспензии эритроцитов (несенсибилизированной);

б) спектральной характеристики пропускания раствора ФС.

Эти кривые позволяют определить как предпочтительную длину волны источника засветки, так и длину волны, на которой следует вести измерения Ти Д для наиболее заметного проявления ФДЭ. Очевидно, что первая должна быть близка к максимуму поглощения ФС, вторая — к максимуму экстинкции суспензии эритроцитов. Доза облучения (в относительных единицах) определяется посредством измерения времени облучения.

В качестве контрольного как в начале, так и по окончании опыта следует Провести изМерение плотности потока излучения (освещенности), даваемой используемым источником. Это необходимо для того, чтобы можно было считать зависимость дозы Р облучения от времени г линейной (обеспечение линейности, согласно формулам (ПЗ) и (П8) приложения, имеет место только при )с = сопзг).

Рас. 9. Расчетные дазовые кривые в врелположении о преобладании

химического механизма тушения

Правильное построение дозовых кривых для ФДЭ должно определяться:

а) выбором концентрации зритроцитов в суспензии в соответствии с исходным пропусканием образца в пределах

б. 11ОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

1. Изучить описание методики измерений и экспериментальное оборудование (см. равд. 5).

2. Приготовить растворы ФС в дистиллированной воде, сьить необходимые характеристики пропускания растворов с

19

сканирование00060

Распознанный текст из изображения:

помощью колориметра (Т = 60...70 %) Поместить заготовленные растворы в темноту.

3 Приготовить суспензию эритроцитов нужной концентрации путем разбавления предложеяного образца крови физраствором (Т = 20...30 %). Предпочтительнее использовать кровь с введенными консервантами (гепарин и др.) для повышения стабильности ее оптических характеристик. Снять спектральную характеристику пропускания приготовленной суспензии и выделить оптимальную длину волны лля наблюдения ожидаемого ФДЭ.

4. Приготовить с каждым из ФС не менее 3 проб. Сначала готовят контрольную пробу, которую сразу помещают в темноту. Затем готовят две одинаковых пробы «ФС + эритроциты», одну из которых облучают сразу, а другую после инкубации (выдерживание в темноте в течение определенного времени). Далее готовят третью пробу — «ФС + эритроциты + ингибитор» — и повторяют те же действия. Зафиксировать время приготовления одной из проб «ФС + эритроциты> для дальнейшего подсчета времени инкубации. Инкубация проводится для накопления ФС в клетке. Время инкубации ФС фотогема должно составлять не менее получаса, ФС фотосенса — около часа. Поместить все обрашы в темное место (лабораторный шкаф)

5. Измерить начал ную плотность всех проб с г!омощью колориметра.

б Провести ви уальный контроль всех проб с помощью микроскопа Зарис вать результаты наблюдений с указанием характерных размеров эритроцитов и других наблюдаемых микрообъектов.

7. Измерить плотность потока выбранного источника излучения Начать облучение одной из проб «ФС -1- эритроциты>, выбрав время облучения перед первым измерением не более 0,5 минут. Проводить измерения оптической плотности и прапускания образцов после каждого облучения. При этом необлучаемые в данный момент образцы должны находитъся в темноте При каждом измерении осуществлять визуальный контроль состояния эритроцитов с помощью микроскопа. Каждое измерение должно быть выполнено не менее 5 раз для расчета среднего значения и среднеквадратичной ошибки измерения. При появлении эффекта (изменение оптической плотности образца) измерения вести каждую мияуту.После окончания серии измерений (выхода на плато оптической плотности) осуществить повторный контроль освещенности. Данные измерений представить в виде таблицы

8 Сравнить полученные экспериментальные результаты с теоретической зависимостью, рассчитанной по формуле (П1Н приложения. Построить графики всех полученных экспериментальных кривых

9. Выполнить пп. 3 — 7 с каждым из предложенных преподавателем ФС. Оценить по данным измерений дозу облучения, полученную каждой из облученных проб.

10. Составить отчет о работе Отчет должен включать: а) описание опытов; б) анализ полученных результатов.

КОНТРОЛЬНЫК ВОПРОСЫ

1. Описать последовательность передачи энергии возбуждения при ФДЭ от света к окисленному субстрату. Что произойдет, если квантовый выход интерконверсии для двух выбранных ФС составляет в одном случае 0,01, в другом — 0,9? Следует ли вообпге отказаться от ФС с ? = 0,01, ияи его все же можно использовать? Для какой цели?

2. Допустим, что преобладает не химическое, а физическое тушение. Следует ли отсюда, что дозовая кривая вообще выродится в прямую !и — =- сопзг или нет? Как в лабораторных ус-

Х

Х»

ловиях оценить вклад физического механизма тушения в случае реальных ФС?

3. Как извесгно, триллетные уровни могут испытывать рас' щецление в магнитном поле. Исходя из этого, определить, можно ли управлять ФДЭ с помощью наложения внешнего магнитного поля?

4. Имеются 2 источника излучения засветки типа ОС-150 (некогерентный источник света с квазисплошным спектром). В первом случае для облучения образца сенсибилизированных клеток используется оптическая система зеркального типа (коллимадия пучка с помощью отражения от зеркального покрытия, одинаково отражающего все длины волн, испускаемые источником), во втором — световодный кабедь из волокна, обрезающего излучение ИК диапазона (х > 1,5 мкм). В области максимума поглощения ФС интенсивности облучения одинаковы (поглогценная энергия совпадает). В каком из рассматриваемых случаев следует ожидать более сильного ФДЭ?

20

21

сканирование00070

Распознанный текст из изображения:

~,Д?„„[Р]

а?а .а/с [КН ]

ПРИЛОЖЕНИЕ

Математическое онисание ФДЭ

— = — /с (б — (1 — г)).

с// К»г

(ПЗ)

(ПЦ

23

22

5. Имеется возможность наблюлать ФДЭ в описанной методике измерений с помощью фотоколориметра на двух дЛинах волн: желтого диапазона (преобладает поглощение) и красного

!

(преобладает рассеяние). Исходныс коэффициенты экстинкции

примем равными. Какую из длин воян следует предпочесть для более отчетливого наблюдения ФДЭ?

6. Имеются два типа ФС: эндогенный и экзогенный (первый

лучше проникает через мембрану эрнтропита). Как по характеру дозовых кривых определить тип ФС?

В соответствии со схемой (1) (см. равд. 1) реакций, идущих при ФДЭ, обозначим: [Р], [Р ], [Р„') — малярные концентрации основного, синглетного и триплетного возбужденных состояний ФС соответственно; [ О ), ['Оз] — то же для основного и синглетного возбу»щенного состояний молекулы кислорода; ку и йч — константы люминесцентного распада состояний 5' и Т' ФС соответственно, ас„— константа скорости интерканверсии; /сс — константа скорости образования 'О', асз— константа окисления субстрата; /сз — константа распада состояния '02 всеми остальными путями, кроме окисления субстрата; /са — константа возможного восстановления окисленного субстрата.

Тогда система кинетических уравнений для малярных концентраций соответствующих веществ запишется так:

4Р:]

а а

= а,у [Р] — (/с +/с;)[Р;];

~[~'] = К„[Р,']-[Р;](й, й,['О,]);

И['О

' = Д[Р„'И'О,]-['О;](/ »~,[КН,]);

[„' =-,['О;1[КН,]., „[К]

Можно показать, что скорость /Д/отекшцзй 1/е2)рЫ/["',[1)уж;:11111»З»е

цессов в (П1) велика по сравнениЮ а гхош/г/1(]йц, 'П1)в]1)гбе/[~Й1зй

также, что ас,['О,] и /с, т е атсУтствУег чсИа][»а[за)пг(1/»гага/а[]])й(1

ние» Тогда дла концентРации сннглетного гсассаса)ас))л(»Ц»»Ш»1111

записать

(]'12)

/2„

Здесь ?„, =- " — квантовый выход интерконверсни

/с„-» /с

Подсташшя (П2) в последнее уравнение системы (П1), в тддз "

[КН,] а»у»у„с[ Р]

же вводя безразмерные переменные г=- ', 6= — аам» вЂ” -,

К = — , где Ка обозначена суммарная концентрация суб-

/с,

/с» [К»]

страта [К] ь [КН2], получаем

Уравнение (ПЗ) описывает динамику окисления субстрата. Свяжем этот процесс с процессом гибели клеток, содержащих ФС Будем считать, что скорость повреждения клеток пропорциональна доле окисленного субстрата, а скорость репараций— доле неокисленного субстрата. При этом существует постоял. ная вероятность необратимой гибели поврежденных клеток. Блок-схема взаимных превращений клеточных состояний показана на рис. П1, где буквами а, Б,? обозначены удельные скорости переходов клеток из соответствующих состояний.

Рас. П1. Блок-схема взаимных превращений к»с»очных состояний

прн фата»ннамическом поражении клеток

Система дифференциальных уравнений, соответствующих

схеме на рис. П1, будет иметь вид

сканирование00080

Распознанный текст из изображения:

АХ

= — аХь0?; Х(0) = Хо,'

гй

— '= аХ вЂ” (0+7)?б ?;(0) = 0;

гй

— ' = ту„у,(о) = о.

»П

гй

(П4)

Уравнение (ПЗ) вместе с системой (П4) образуют замкнутую модель поражения патологических клеток, в которой параметры б и Х являются управляющими. Константа 0 пропорциональна исходной концентрации препарата и интенсивности излучения. Очевидно, что б а О только на время экспозиции (облучения) пробы Ге, т. е. 6 = 0 при г> То.

Введем безразмерные переменные и параметры для системы (ПЗ), (П4), а также безразмерное время:

Х.

х= —;

В = Оо

1» . ао.

у,=;у»= —;А= —;

(П5)

С = У; ч = »?о! ч ='То)го.

о о».

Окончательно модель ФДЭ описывается системой трех дифференциальных уравнений, если учесть, что а = а,(! — з); 0 = [)ог (где г — доля неокисленного субстрата). При этом условие 1» = 0 в системе (П4) можно заменить условием сохранения полного чисяа клеток Х + 1; +У» = Хе. Тогда

(О, ч < то

(,

— — [1 — 0(ч — ч ) ] + (1 — г);

ел Ст

Ач Х-ох

— = — А(1 — г)х ь В»у„

Ач

— ' = А(! — г)х — (Вг.»С)у,; у, =1

еб

Ач

г(0) = х(0) = 1; у, (0) = у, (0) = О.

(Пб)

— х — у;

24

Решение системы (Пб) может быть получено численно при задании параметров К, б, А, В, С Константа 84 важна для сравнения расчетных кривых с экспериментом и определяется эмпирическим путем (нри наблюдении за облученными клетками через микроскоп) Справедливость описания ФДЭ системой

уравнений чипа (Пб) неоднократно подтверждалась на опьпе, так что она мохгет рассматриваться как базовая при моделировании ФДЭ на ЭВМ.

Вернемся к системе уравнений (ПЦ в предположении о более медленном процессе окисления субстрата по сравнению с предыдущими процессами, сводящейся к одному уравнению

А(В?!») о»у»у,[ 1

(П7)

получающемуся из (ПЗ) при условии пренебрежения процессами репарапии ()го [к] а )сч [Внч]). Входящие в (п7) константы !с» и /сз естественно связать со скоростями химиЧесКого и физического тушения соответственно. Пренебрегая физическим тушением по сравнению с химическим, запишем

А[ВН ] ао? у„„[Р]

Аг [КН,]

(П8)

(П9)

— = ао?оу.. [Р] = ч *

г»те в правой части стоит величина, не зависящая от времени и концентрации субстрата, а определяемая только интенсивностью засветки и конценчрацией введенного ФС; оси у„— внутренние характеристики ФС.

В предположении об отсутствии репаративных процессов система уравнений (П4) также сводится к одному уравнению

АХ

— = — аоуХ,

Аг

(П10)

25

Так как [ВН»]ь(К]=сопзг, то ' = —, а если ис-

А[ВН ] А[К]

гй гй пользовать введенную в (ПЗ) безрюмерную переменную

— , то получим, что = — [ВН» ] — Гибель сенсиби-

[ВН»] Аз А[Р.]

[Ко] гй ' гй лизированных клеток мы связываем (в предположении об отсутствии репараций) с ростом доли окисленного субстрата [Р.].

А[В] Значит, уравнение (П8) удобно переписать лля, ввести

о(г безразмерную переменную у = 1 — г и записать

сканирование00090

Распознанный текст из изображения:

где Х означает численность выживших клеток. Уравнения (П9)

и (ЕПО) образуют систему 2-го порядка, имеющую решение

Х 1

жсаь!

(П11)

при у а=е = 0 и прекращении засветки в момент ь для сравнения с экспериментом удобно ввести следующее обозначение Р =- сг = о,у,у„,[Р]г — доза воздействия. Размерность величины Р при условии безразмерности [Р], есть размерность энергии [Дж]. В соответствии с этим кривы (П1Ц, изображенная в ко-

Х

ординатах (1п —; г), называется деловой кровей. Она определяет относительную концентрацию выживших частиц ХЕХе в зависимости от времени облучении г и дозы облучения Рл Коэффициент се характеризует крутизну дозовой кривой на рис. 9 (см равд. 5). В случае реализации ФДЭ с выполнением допущенных условий (пренебрежение репаративными процессами, преобладание химического механизма тушения, определение доли выживших клеток сразу после прекращения облучения) дозовая кривая, рассчитанная в соответствии с (П11), может сравниваться с экспериментом

СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1 Фотодинамическое действие лазерного излучения на молекулы и клетки. М: Изд-во ВИНИТИ, 1990.

2. Современные методы биофизических исследований: практикум по биофизике Е Под ред. А.Б. Рубина. Мл Высш. шк., 1988.

3. Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения Е Под ред. А.Б. Рубина. Мл Высш. шк., 1988.

А Волькенштейн МВ. Биофизика. Мл Наука, 1988.

5 ЕЕаг и Е.Н: ег а!. ТЬе Бед Сей Ргобпсг[оп, МетаЬо1)зш, Пезгпзспоп: Нонна) апб АЬпопва1. — Напагд Пшч. Ргеы, Сашбг)бис, 1970.

6. Лазеры в клинической медицине Е Под ред. С.Д. Плетнева. М . Медицина, 1996.

Картинка-подпись
Хочешь зарабатывать на СтудИзбе больше 10к рублей в месяц? Научу бесплатно!
Начать зарабатывать

Комментарии

Поделитесь ссылкой:
Рейтинг-
0
0
0
0
0
Поделитесь ссылкой:
Сопутствующие материалы
Свежие статьи
Популярно сейчас
А знаете ли Вы, что из года в год задания практически не меняются? Математика, преподаваемая в учебных заведениях, никак не менялась минимум 30 лет. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Нашёл ошибку?
Или хочешь предложить что-то улучшить на этой странице? Напиши об этом и получи бонус!
Бонус рассчитывается индивидуально в каждом случае и может быть в виде баллов или бесплатной услуги от студизбы.
Предложить исправление
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
5076
Авторов
на СтудИзбе
455
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее