ВКР: Исследование роли протеасом в появлении укороченной формы альфа-тубулина в клетках человека

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................................................... 3

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................... 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................ 6

Протеасома. Строение и состав............................................................................................... 6

Типы протеасом........................................................................................................................ 9

Убиквитин протеасомный путь деградации белков............................................................ 10

Процессинг.............................................................................................................................. 12

Убиквитин-независимый протеолиз..................................................................................... 13

Участие убиквитин-протеасомной системы в клеточных процессах................................ 14

Многообразие тубулинов. Функции..................................................................................... 15

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................................................................... 18

Работа с клетками эукариот в культуре................................................................................ 18

Молекулярно-биохимические и физико-химические методы............................................ 18

Методы работы с бактериями Escherichia coli..................................................................... 23

РЕЗУЛЬТАТЫ............................................................................................................................. 25

Масс-спектрометрический анализ аффинно-очищенных протеасом................................ 25

Верификация масс-спектрометрических данных с помощью иммуноблотинга.............. 27

Создание генетических конструкций для экспрессии рекомбинантного α-тубулина.... 28

Подбор условий для экспрессии и очистки рекомбинантных α-тубулинов..................... 30

Проверка результатов очистки рекомбинантного α-тубулина Вестерн-блот анализом.. 31

Протеолиз α-тубулина протеасомой in vitro......................................................................... 32

ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................................................................... 34

ВЫВОДЫ.................................................................................................................................... 39

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................................... 39

ПРИЛОЖЕНИЕ А....................................................................................................................... 45






















2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

УПС – убиквитин-протеасомная система

СЕ – субъединица

ИП – иммунопротеасома ИПТГ - Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид ПААГ - полиакриамидный гель ПЦР – полимеразная цепная реакция BSA – бычий сывороточный альбумин

EBV - Epstein–Barr virus (вирус Эпштейна-Барр)

His - последовательность из шести или восьми гистидинов HTBH - сложный полипептид, состоящий из двух последовательностей из шести гистидинов (H), специфического сайта расщепления TEV-протеазой (T) и сигнальной последовательности для биотинилирования in vivo(B) MBP – основный белок миелина (myelin basic protein)

PBS – фосфатно-солевой буфер

PBSt – 0,1% tween-20 фосфатно-солевой буфер

PVDF - polyvinylidene fluoride (поливинилиденфторид)

SDS - sodium dodecil sulphate (додецилсульфат натрия)

TEV - Tibacco Etch virus

































3

ВВЕДЕНИЕ

Мультисубъединичный белковый комплекс, отвечающий за избирательную деградацию большинства белков в эукариотической клетке, называется 26S протеасомой. За счет деградации специфических регуляторных белков она играет центральную роль в основных клеточных процессах: клеточной дифференцировке и развитии, транскрипции и репарации ДНК, продвижении клетки по клеточному циклу, иммунном и воспалительном ответах, апоптозе (Цимоха, 2010).

На сегодняшний день прослеживается связь между патогенезом различных заболеваний, включая нейродегенеративные, аутоимунные и онкологические, и нарушениями в работе убиквитин-протеасомной системы. Причинами заболеваний может стать как ингибирование работы этой протеолитической системы, так и ее чрезмерная активность. Тот факт, что работа протеасомы тесно связана с патогенезом многих заболеваний, наводит на мысль о возможности изменения течения этих заболеваний. Поэтому так важно широкое и комплексное изучение механизма работы убиквитин-протеасомной системы и способов регуляции функционирования протеасом в клетке.

Существует ряд белков с известными и неизвестными функциями, которые постоянно или краткосрочно связываются с 26S протеасомами