Ядерные методы анализа
Лекция №10
Ядерные методы анализа
Ядерные (атомно-физические) методы лабораторного анализа относятся к группе методов, позволяющих изучать тонкую структуру компонентных биопроб. Они основаны на взаимодействии с проникающими излучениями, эффект от которого проявляется на молекулярном и атомарном уровнях.
Ядерные методы используют различные проявления взаимодействия излучений с веществом, а также эффекты ядерных взаимодействий:
— явление радиоактивности, т, е. способности атомных ядер самопроизвольно или искусственно распадаться;
— излучения корпускулярного или электромагнитного потоков, формируемых под действием ряда физических факторов;
— явление ионизации вещества, которое используется для регистрации распределения ионных пакетов (пучков) в пространстве и во времени. При этом пакеты ионов формируются из молекул исследуемого вещества и разделяются в зависимости от отношения массы иона к его заряду;
— явления резонансов, наблюдаемые под действием переменных по частоте электромагнитных и магнитных полей. При этом регистрируются характерные спектры, отражающие структуру и состав вещества или зависящие от концентрации компонентов;
Рекомендуемые материалы
— явление взаимодействия вещества с рентгеновским излучением, в результате которого регистрируются спектры рентгеновского излучения, отражающие состав исследуемых проб, или дифракционные картины, отражающие особенности структуры вещества;
— явление взаимодействия вещества с потоком электронов, лежащее в основе методов электронной микроскопии.
Основными видами излучений, используемых при ядерных методах лабораторного анализа, являются корпускулярные излучения (альфа- и бета-частицы) и электромагнитные излучения (рентгеновское и гамма-излучение). Эти излучения возникают при радиоактивном распаде, причем имеет место как распад ядер по одному из видов распада, так и одновременно по нескольким видам. Ядерные процессы протекают с выделением очень больших энергий. Если химические реакции требуют энергий порядка 10 эВ/атом, то ядерные реакции — тысячи и миллионы эВ/атом.
Скорость радиоактивного распада можно определить из выражения
(4.5)
где N — число распавшихся атомов; N0 — число атомов до начала распада; — постоянная распада, характеризующая вероятность распада на один атом в единицу времени t, определенная для любого элемента.
Другой величиной, характеризующей распад, является период полураспада ; T0,5 различных веществ колеблется от 10-6 до 1010 лет. Внешние условия не сказываются на экспоненциальном законе распада, что крайне важно в процессе измерений.
Различают три типа процесса взаимодействия вещества с излучением:
— фотоэлектрическое поглощение, сопровождающееся излу-чением кванта рентгеновского излучения при переходе электрона с внешней оболочки на внутреннюю за счет энергии фотоэффекта. Оно характерно для малых энергий и описывается уравнением:
,
где w — энергия связи электрона в атоме; — кинетическая энергия электрона.
При малых энергиях существенную роль начинает играть также релеевское рассеяние на связанных электронах атомов, и при определенных условиях может проявиться резонансное поглощение энергии внешних электрического и магнитного полей. Резонансные процессы поглощения и рассеяния оказываются существенными лишь в очень узких (резонансных) областях энергии, положение которых в энергетическом спектре индивидуально для различных элементов. Энергия рентгеновского характеристического излучения при этом невелика:
— комптон-эффект — упругое рассеяние кванта на свободном электроне — имеет место, когда энергия кванта значительно превышает энергию связи электрона. Часть энергии кванта передается электрону, который может быть выброшен из атома, при этом направление движения кванта может измениться на некоторый угол , а электрон тоже отклоняется от направления движения кванта на угол , в общем случае не равный Вероятность комптоновского рассеяния пропорциональна количеству электронов в атоме, т. е. атомному номеру вещества;
— образование пар электрон-позитрон, которое начинает проявляться при энергиях выше 1,022 , при этом избыточная энергия взаимодействующего кванта переходит в кинетическую энергию образовавшейся пары. Для того чтобы при образовании пары сохранялись энергия и импульс, процесс должен происходить в присутствии третьего тела — ядра или электрона, на котором рассеивается остальная часть энергии кванта. Процесс поглощения квантов по принципу образования пар главным образом происходит у тяжелых элементов.
Одной из важных характеристик взаимодействия излучения с веществом является проникающая способность, которая оценивается толщиной слоя двойного поглощения ,где — коэффициент поглощения. Ослабление излучения, создаваемое слоем вещества толщиной h, характеризуется кратностью ослабления . Величина ослабления зависит от угла падения излучения и уменьшается, если поток квантов направлен под углом к поверхности облучаемого объекта.
МЕТОДЫ, ОСНОВАННЫЕ НА ЯВЛЕНИИ
РАДИОАКТИВНОСТИ
Методы анализа, основанные на явлении и эффектах радиоактивности, используют вещества-радиоизотопы, способные спонтанно или вынужденно распадаться с получением из ядра корпускулярного или электромагнитного излучения. Число радиоизотопов в настоящее время превышает 1100.
Сущность использования изотопов заключается во введении их в исследуемую систему и контроле перемещения или концентрирования в процессе функционирования данной системы. По распределению радиоизотопов в образце можно выявлять области с большей или меньшей относительной концентрацией интересующих исследователя соединений, определять размеры этих областей, изучать особенности протекания реакций/Введение активных изотопов в соединения и регистрация их, а также вторичных излучений позволяют получать информацию о составе и структуре исследуемых сред. Радиоизотопный метод приобрел большое значение для медико-биологических лабораторий, где с его помощью уже можно определить более 50 различных биологических соединений. Основным преимуществом радиоизотопного метода по сравнению с другими является возможность изучения равновесных биологических процессов без нарушения их химического равновесия.
Все медико-диагностические радиоизотопные методики исследования можно разделить на две группы:
— in vivo — осуществляются на целом организме человека;
— in vitro — проводятся в предварительно отобранной из организма пробе.
Все исследования биопроб можно также разделить на два типа в зависимости от способа введения радиоактивного (РА) препарата: в первом случае РА-вещество предварительно вводится в организм, после чего уровень радиоактивности через определенное время измеряется в отобранной пробе (например, в крови); во втором — РА-препарат в организм вообще не вводится, а служит маркером для выявления конкретного компонента пробы (например, радиоиммунологический).
При выборе типа радиоизотопа должны выполняться некоторые специфические требования:
— учет характерности соединения для изучаемых процессов, которая выражается тропностью — отношением концентрации вводимого вещества к естественной концентрации этого вещества в исследуемой биопробе;
— минимальная токсичность соединений для исследователей, что определяет концентрацию используемых радиоизотопов;
— обязательный контроль процессов взаимодействия вводимого радиоизотопного индикатора с компонентами соединений;
— учет естественной убыли активности изотопа при анализе результатов (определяется временем полураспада Т0,5).
Для регистрации активности радиоизотопов используются методы спектроскопии ионизирующих соединений.
Одним из вариантов радиоизотопного метода является авторадиография ,в основе которой лежит фотохимический процесс. Вещество биопробы, содержащее предварительно введенные радиоизотопы, приводится в соприкосновение с фотоэмульсией на пленке. Интенсивность почернения эмульсии пропорциональна концентрации исследуемого компонента. Количественные измерения проводят на денситометрах после проявления пленки.
При исследованиях жидких проб их необходимо предварительно подготовить. С этой целью пробу наносят на подложку (чаще всего стеклянную). Затем препарат окрашивают красителями, содержащими радиоактивные изотопы. Эти вещества концентрируются на отдельных участках в соответствии с зонами исследуемого вещества.
Основной характеристикой метода является разрешающая способность, которая определяется как линейное расстояние между двумя точечными источниками излучения, различаемыми как отдельные на проявленной пленке. На достоверность авторадиограммы влияют качество фотоэмульсии, расстояние от поверхности образца до пленки, а также вид излучения. Альфа-излучение вызывает сильную ионизацию эмульсии, но оно токсично; а бета-излучение дает расплывчатое изображение. Широкое распространение получило гамма-излучение, хотя оно имеет более низкую ионизирующую способность.
Метод гамма-резонансной спектроскопии (ГРСС) основан на изучении зависимости числа гамма-квантов, прошедших через образец (т. е. интенсивности поглощенного гамма-излучения), от частоты излучения гамма-квантов РА-изотопом.
Метод позволяет получить необходимые сведения о строении молекул. Разная частота излучения создается изменением скорости перемещения источника гамма-излучения относительно образца (эффект Доплера). При определенной частоте гамма-излучения ядра атомов, поглощая гамма-кванты, переходят из нормального состояния в возбужденное. В спектре этому эффекту соответствует минимум пропускания (рис. 4.12.).
Эффект Мессбауэра, на котором основана гамма-спектроскопия, заключается в том, что относительная энергия основного и возбужденного состояний ядра атома зависит от электронной плотности около него. Поэтому метод оказывается чувствительным при изучении строения электронных оболочек атомов в различных химических соединениях.
Как уже отмечалось, при исследовании структуры и свойств молекул, взаимодействия молекул в растворах, процессов ассоциации молекул находит применение флуоресцентный анализ. Одной из разновидностью этого метода является рентгенофлуоресцентный анализ.Такие характеристики, как спектр излучения и длительность, не зависят от вида возбуждения. Флуоресценция с помощью радиоактивных веществ подкупает простотой своей технической реализации, поэтому она нашла применение при исследовании многих жидких биопроб и структуры биологических микрообъектов.
Рис. 4.12. Типичный спектр для гамма-резонансной спектроскопии
Весьма чувствительным (нанограммы вещества и менее на 1 мл пробы) и специфичным методом исследования некоторых биологических веществ (в частности, антигенов и антител) в жидких пробах является радиоиммунологический анализ , технологическая процедура которого подробно рассмотрена ранее. Принцип РИА состоит в применении радиоактивного изотопа, который действует как маркер исследуемого вещества. Оценка результата производится количественно с помощью различных счетчиков радиоактивности.
Принципиальным для радиоиммунологического исследования является введение в анализируемую смесь специфического реагента в определенной концентрации. В зависимости от этого реагента различают несколько модификаций метода. Так при введении специфических связывающих белков проводится конкурентный белковосвязный анализ ;при введении специфических энзимов—радиоэнзимный анализ : при введении специфических микроорганизмов—радиомикробиологический анализ и т.п.
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Метод масс-спектрометрии (МСМ) основан на ионизации атомов и молекул изучаемого вещества и последующем разделении образовавшихся ионов в магнитном и электрическом полях. Определение содержания в смесях различных по химическому и изотопному составу соединений и их молекулярный или атомный вес производится на основе регистрации ионных пучков (пакетов), полученных при ионизации и последующем разделении вещества.
Для ионизации пробу облучают фотонами, ионами, воздействуют на нее электрическим полем и др. В ходе дальнейшего эксперимента происходит пространственное разделение пучков ионов с разными отношениями массового числа иона m к его заряду q (масс-спектр) (под массовым числом понимается сумма протонов и нейтронов ядра). В основе разделения лежит свойство ионов менять направление или скорость своего движения в электрическом и (или) магнитном полях в зависимости от масс-спектра частицы.
При проведении исследования последовательно выполняют следующие операции:
— перевод образцов твердых или жидких сред в газообразное состояние;
— ионизация молекул анализируемого вещества и форми-рование ионного пучка;
— разделение ионного пучка по массам в магнитном и (или) электрическом полях;
— улавливание ионов;
— раздельное измерение и регистрация ионных токов каждой составляющей ионного пучка.
Принцип разделения ионов можно пояснить следующим образом (рис. 9.2). Пусть ионы вещества, вылетая из узкой щели, двигаются в однородном поперечном магнитном поле с напряженностью Н. Щель, расположенная в точке S, выделяет ионы в пределах угла 2α, и ионы будут двигаться по окружности с радиусом Центральный луч пересечет ось в точке х0 = 2r, а лучи, прошедшие у края щели, пересекут ось в , при этом ширина изображения.Если угол мал, то
,
где ν_ начальная скорость вылета иона; определяется параметрами масс-спектрометра.
Рис. 4.13. Принцип разделения ионов в масс-спектрометрии
Таким образом, ионы с разными масс-спектрами (m/q) будут сфокусированы в разных точках оси. Меняя напряженность магнитного поля, можно последовательно фокусировать в одну точку ионы с разными отношениями (m/q) и построить масс-спектрограмму N=f(m) (рис. 4.14.). Аналогичная картина возникает при использовании электрического поля. Неискаженное движение ионов возможно только в высоком вакууме (давлении не свыше 10-7 ртутного столба).
В масс-спектрометрии возможно использование:
— постоянных или медленно изменяющихся во времени полей;
— полей, период изменения которых соизмерим со временем движения ионов;
— комбинации последовательно расположенных электрических и магнитных полей.
Использование статических электрических полей позволяет разделить ионы только по энергиям, в статических магнитных полях они разделяются по массам. Возможна комбинация последовательно расположенных электрических и магнитных полей, определенный подбор которых позволяет значительно улучшить разделительные свойства метода. С применением переменного электрического поля возникает возможность разделения ионов в зависимости от их энергии и во время движения. При этом различать ионы по энергии позволяет постоянное магнитное поле, которое используется в сочетании с переменным электрическим. Переменное магнитное поле не нашло применение в масс-спектрометрии
Для получения информации об исследуемом веществе необходимо зарегистрировать соответствующий ему массовый спектр, который образуется при пространственном распределении ионов.
Рис. 4.14. Типичная масс-спектрограмма сложного соединения
Основными параметрами спектра являются высота (или интенсивность) пиков, зависящая от количества ионов данной массы, которые поступают на детектор, и значение массы ионов, соответствующее каждому пику. По относительной интенсивности каждого выделенного пучка определяют концентрации компонентов анализируемой смеси, а по масс-спектрам — точные формулы молекул и молекулярные массы. При определении массы различных ионов необходимо чтобы пики, соответствующие этим ионам, были четко разделены.
Лекция № 11
МЕТОДЫ, ОСНОВАННЫЕ НА ЯВЛЕНИЯХ РЕЗОНАНСОВ
Резонансные методы основаны на квантовомеханических эффектах, которые заключаются в том, что магнитные диполи (которыми являются молекулы исследуемого образца) ориентируются во внешнем магнитном поле таким образом, чтобы проекции магнитных моментов направления поля могли принимать дискретный ряд значений. Каждое дискретное значение соответствует определенной энергии взаимодействия диполя с внешним магнитным полем. При комнатной температуре в объекте реализуются все разрешенные ориентации магнитного момента. Если же к молекуле подвести порцию энергии, в точности равную разности энергий молекулы в состояниях с различной величиной проекции магнитного момента, то этот квант энергии будет поглощен.
Энергия кванта определяется его частотой, поэтому имеет место поглощение энергии при строго определенной частоте. Явления резонансов, выражающиеся в интенсивном поглощении или излучении энергии веществом при возбуждении его переменными электрическим, магнитным или электромагнитным полями, порождают целый ряд тонких и высокоточных радиоспектрометрических методов изучения свойств компонентов пробы.
К радиоспектроскопическим методам анализа, изучающим взаимодействие вещества с излучением в радиочастотном диапазоне, относятся спектроскопия ЯМР и ЭПР. Оба метода основаны на явлении магнитного резонанса — избирательном поглощении электромагнитного излучения в радиочастотном диапазоне и обусловлены магнитными свойствами частиц (электронов и ядер).
Различают несколько видов магнитного резонанса в атомах и других субмикрочастицах.
Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) — резонансное поглощение электромагнитной энергии в веществах, обусловленное магнетизмом ядер. Метод анализа, основанный на ЯМР, можно использовать для изучения всех ядер, которые обладают собственным моментом количества движения (спином) и связанным с ним магнитным моментом.
Резонанс наблюдается в сильном постоянном магнитном поле, на которое для получения эффекта резонансного поглощения накладывают более слабое радиочастотное магнитное поле. В магнитном поле для спина ядра могут реализоваться две ориентации: вдоль и против направления силовых линий внешнего поля. Каждому значению спина соответствует определенное значение энергии. Переориентация спина ядра из состояния с меньшей энергией (направление против поля) в состояние с большей энергией (направление вдоль поля), что, собственно, и происходит при наложении радиочастотного магнитного поля с определенной частотой, сопровождается поглощением энергии (т. е. наблюдается явление магнитного резонанса).
Поглощение энергии происходит при переориентации спина ядра из состояния с меньшей энергией (направление против поля) в состояние с большей энергией (направление вдоль поля), что и происходит при наложении радиочастотного магнитного поля.
Такое поглощение энергии может быть обнаружено по наведенной ЭДС в катушке индуктивности, окружающей исследуемую пробу. Процесс исследования сводится к снятию спектра ЯМР и его расшифровке. По спектру ядерного магнитного резонанса можно определить свойства ядер, строение молекул, подвижность частиц в различных условиях.
Чрезвычайно широко метод ЯМР применяется при исследовании протонного резонанса в атомах водорода — ядерный протонный резонанс (ЯПР). Рассмотрение спектра протонного резонанса неизвестного органического соединения дает сведения о том, в какие его радикалы (группы) входит водород и, следовательно, каково строение этого вещества.
О природе химических связей в веществе позволяет судить ядерный квадрупольный резонанс (ЯКР), наблюдаемый при введении ядра в неоднородное электрическое поле. Квадрупольный момент характеризует отклонение распределения электрического заряда ядра от сферической симметрии, поэтому при неоднородности электрического поля у ядер атомов или ионов на спектре ЯКР появляется характерный сигнал.
Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) — резонансное поглощение энергии радиочастотного поля в веществах, содержащих парамагнитные частицы, при наложении постоянного магнитного поля. В основе ЭПР, как и ЯМР, лежит принцип магнитного резонанса, однако ЭПР-сигналы при одном и том же значении напряженности постоянного магнитного поля расположены в области более высоких частот (микроволновая область).
ЭПР представляет собой совокупность явлений, связанных с квантовыми переходами между энергетическими уровнями атомов или молекул под влиянием переменного магнитного поля резонансной частоты. Метод ЭПР позволяет определить положение энергетических уровней парамагнитных частиц (атомов, ионов, радикалов и молекул, имеющих неспаренные электроны). Частота, при которой происходит резонанс, пропорциональна напряженности внешнего магнитного поля, поэтому спектр ЭПР покушает зависимость интенсивности поглощения исследуемым веществом энергии радиочастотного поля заданной частоты от величины напряженности постоянного магнитного поля. Появление или отсутствие спектра ЭПР в пробе дает полезную информацию о строении вещества, радикальном или ионно-радикальном механизме реакции, особенностях электронной структуры тяжелых атомов.
При помощи метода ЭПР удается провести количественные изучения диффузии свободных радикалов, исследовать ферментативные процессы, сопровождающиеся превращениями свободных радикалов. При исследовании жидких биопроб ЭПР наблюдается также в растворах, содержащих ионы VO2+, Cr3+, Mn2+, Fe3+, Cu2+ и некоторые другие. В качестве растворителей могут выступать вода, спирты, глицерин, ацетон и т. п.
При воздействии на вещество переменными электромагнитными полями двух различных частот имеет место двойной резонанс, нашедший применение при исследовании оптически возбужденных веществ. Возможны также и другие типы резонансов.
МЕТОДЫ РЕНТГЕНОВСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
Возможности изучения состава и структуры сложных веществ по характеристическим рентгеновским спектрам непосредственно следуют из закона Мозли, утверждающего, что квадратный корень из численных значений термов для линий спектров испускания или для основного края поглощения является линейной функцией атомного номера элемента или заряда ядра. Терм — числовой параметр, характеризующий частоту спектров поглощения. Линии характеристического рентгеновского спектра немногочисленны. Для каждого элемента их число вполне определенное и индивидуальное.
Достоинством анализа рентгеновского спектра [метод рентгеновской спектрометрии является то, что относительная интенсивность большинства спектральных линий постоянна, и основные параметры излучения не зависят от химического состава соединений и смесей, в которые входит данный элемент. В то же время количество линий в спектре может зависеть от концентрации данного элемента: при очень малых концентрациях элемента в спектре соединения появляются только две-три ярко выраженные линии. Для анализа соединений по спектрам необходимо определить длины волн основных линий (качественный анализ) и их относительную интенсивность (количественный анализ). Длины волн рентгеновских лучей имеют тот же порядок, что и межатомные расстояния в кристаллических решетках исследуемых веществ. Поэтому, регистрируя спектр отраженного излучения, можно получить представление о составе исследуемого соединения.
Известны разновидности метода , в которых используются вторичные эффекты, сопровождающие процесс взаимодействия рентгеновского излучения с веществом биопробы. К данной группе методов в первую очередь относятся эмиссионная рентгеноспектрометрия , при которой регистрируется рентгеновский спектр, возбужденный электронами, и абсорбционная рентгеноспектрометрия , по механизму взаимодействия излучения с веществом аналогичная методу абсорбционной спектрофотометрии.
Чувствительность методов очень сильно меняется (от 10-4 до 5,10-10 %) в зависимости от выхода характеристического излучения, контрастности линий, метода возбуждения, методов регистрации и разложения излучения в спектр. Количественный анализ данных можно проводить по спектрам излучения (первичным и вторичным) и спектрам поглощения. Невозможность строгого учета взаимодействия излучения с атомами вещества, а также влияния всех условий проведения измерения заставляют ограничиваться измерениями относительной интенсивности излучений и использовать методы внутреннего или внешнего стандарта.
При исследовании структуры и свойств молекул, процессов ассоциации молекул и взаимодействия их в растворах широко применяется рентгенофлуоресцентная спектрометрия , о которой уже говорилось выше.
Длины волн рентгеновских лучей имеют тот же порядок, что и межатомные расстояния в кристаллических решетках исследуемых веществ. Поэтому при взаимодействии рентгеновского излучения с пробой возникает характерная дифракционная картина, отражающая особенности структуры кристаллических решеток или дисперсных систем, т. е. характеризующая состав исследуемого соединения. Исследование структуры соединений и их отдельных компонентов по дифракционным картинам рассеяния рентгеновского излучения на кристаллических решетках и неоднородностях структур положено в основу рентгеноструктурного анализа . Регистрация спектра может осуществляться с помощью фотографической пленки (качественный анализ) либо ионизационных, сцинтилляционных или полупроводниковых детекторов. Данный метод позволяет определять симметрию кристаллов, величины, форму и типы элементарных ячеек, проводить количественные исследования гетерогенных растворов.
МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Значительное увеличение разрешающей способности в микроскопе можно получить при использовании пучков быстролетящих в вакууме электронов. Эффект взаимодействия электронных пучков с веществом используется в электронных микроскопах. Принципиально разрешение электронного микроскопа могло бы превосходить разрешение светового микроскопа в сотни тысяч раз, так как эквивалентная длина волны для электрона
, (4.6)
где h — постоянная Планка; U— ускоряющая разность потенциалов.
Однако разрешение определяется не только явлениями дифракции, но и различными аберрациями электронных линз, используемых для фокусировки электронных пучков. Эти аберрации полностью некоррелируемы, хотя и несколько исправляются главным образом диафрагмированием и применением электронных пучков малых апертур. Поэтому разрешение современных электронных микроскопов не превышает 0,45—0,5 мкм и всего в несколько сот раз выше разрешения лучшего светового (ультрафиолетового) микроскопа (200—250 мкм).
Ещё посмотрите лекцию "6 Интеграл от функции комплексной переменной" по этой теме.
Окончательное изображение в микроскопе формируется на флуоресцирующем экране или фотопластинке. Контраст изображения определяется долями электронов, рассеянных на микроучастке и прошедших через апертуру. Для управления электронными пучками используются центрированные максимально симметричные электрические и магнитные поля, т. е. электронные линзы электростатического или магнитного типов. При получении изображений достаточной яркости непосредственно в электронном микроскопе с увеличением в несколько сот тысяч раз плотность тока на объекте должна достигать нескольких ампер на квадратный сантиметр. Чтобы уменьшить нагрев образца, приходится сильно уменьшать облучаемую область (до нескольких квадратных микрометров). Важным достоинством электронного микроскопа является большая глубина резкости, превосходящая почти на три порядка глубину резкости оптического микроскопа.
Метод эмиссионной электронной микроскопии позволяет получить изображение объекта в электронах, которые эмитирует сам объект. Эмиссия может быть результатом нагрева (термоэлектронная эмиссия), освещения (фотоэлектронная эмиссия), бомбардировки электронами или ионами (вторичная электронная или ионно-электронная эмиссия), действия сильных электрических полей (автоэлектронная эмиссия). Разрешение эмиссионных микроскопов значительно хуже просвечивающих ив зависимости от типа эмиссии достигает 20—100 мкм.
В методе отражательной электронной микроскопии () изображение формируется в отраженных образцом электронах. Распределение отраженных электронов существенно зависит от углов облучения и наблюдения, а также от материала образца. Разрешение такого микроскопа не выше 25—30 мкм.
В методе растровой электронной микроскопии (РЭМС) образец сканируется тонким электронным пучком, обегающим за время развертки всю исследуемую поверхность. В каждой точке соприкосновения электронного луча с веществом возникает ряд излучений: вторичные и рассеянные электроны, рентгеновские лучи, световое излучение и т. д., которые используются для получения изображений на экранах электронно-лучевых трубок. Разрешение растровых микроскопов определяется диаметром пучка и видом используемого излучения.
Теневое изображение объекта получается с помощью метода теневой электронной микроскопии (ТЭМС), при котором тонкий электронный пучок, облучающий образец, остается неподвижным. Разрешение теневого микроскопа определяется диаметром пучка и характером дифракционных явлений. На образование изображения влияют различия в рассеянии и поглощении электронов разными участками образца. Яркость изображения получается значительно ниже, чем при использовании метода просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМС), и для ее увеличения возможно применение способов повышения контраста, например, с помощью электронно-оптических преобразователей.
Непосредственное исследование жидких проб в электронных микроскопах невозможно, поэтому обязательной является предварительная их подготовка: обезвоживание, высушивание и заключение в некоторую формирующую среду, которая исключает появление артефактов, способных исказить результаты исследований.