Лекция №8

 ВВЕДЕНИЕ В ЧАСТНУЮ   МИКРОБИОЛОГИЮ

МОРФОЛОГИЯ     И   ФИЗИОЛОГИЯ ВИРУСОВ

ЭНТЕРОВИРУСЫ

Длительное сосуществование популяций человека и микроорга­низмов в процессе эволюции привело к формированию больного коли­чества видов микробов, способных вступать в паразитическое взаи­модействие с макроорганизмом, проявляющееся в виде той или иной инфекции. Насчитывают сотни нозологических форм инфекционных за­болеваний. 3 основе их классификации лежат свойства и таксономи­ческое положение возбудителя, механизм заражения и поражаемые ткани, клинико-эпидемиологические особенности заболевания.

Различают следующие инфекции: кишечные (их возбудители попа­дают в организм благодаря постоянству пищевой связи человека с внешней средой), например, холера, брюшной тиф, дизентерия и др.; респираторные (инфекции дыхательных путей), например, грипп, корь, дифтерия и др.; кровяные (их возбудители при зара­жении попадают в кровь, которая для них является основным мес­том обитания в организме), например, сыпной тиф, клещевой энце­фалит, вирусный гепатит и др.; а также инфекции, передающиеся контактным путем (через соприкосновение с больным, микробоносителем или предметами, контаминированными их выделениями), в частности, венерические болезни, передающиеся, в основном, поло­вым путём, например, сифилис, гонорея, трихомониаз и др.

Микробиологическая диагностика инфекций вызванных безусловнопатогенными микробами основана на следующих принципах.

1.Обнаружение микроба (его антигенов или нуклеиновых кислот) в организме больного или его выделениях. При этом имеет значение правильность взятия материала (в зависимости от Формы, стадии заболевания, особенностей возбудителя и др.). Исследование прово­дят различными методами:

а) микроскопическим - микроскопия нативных и/или окрашенных пре­паратов (существенное значение метод имеет при заболеваниях, возбудители которых имеют отличительные морфолого-тинкториальные особенности, например, при туберкулёзе, дифтерии, спирохетозах, протозойных заболеваниях);

б)микробиологическим - посев материала от больного на питатель­ные среды с последующим выделением чистой культуры и идентифика­цией возбудителя по морфолого-тинкториальным, культуральным, ферментативным (биохимическим), антигенным и другим свойствам (метод имеет абсолютное диагностическое значение, но у него есть

ограничения при тех инфекциях, возбудители которых плохо иди долго растут на питательных срезах, выделение чистой культуры сопряжено с высокой опасностью заражения и т.п.);

в)экспериментальный - заражение материалом восприимчивых лабо­раторных животных, что позволяет в ряде случаев получить у них клинические признаки соответствующей инфекции, учесть реакцию нейтрализации микробного токсина, выделить чистую культуру воз­будителя и оценить её вирулентность (диагностическое значение метод имеет при обнаружении возбудителей, способных при зараже­нии данных животных проявлять специфические патогенные свойс­тва).

Рекомендуемые материалы

В тех случаях, когда заболевание относится к особо опасным или некоторым другим инфекциям, проводят экспресс-диагностику -быстрое обнаружение (индикацию) в исследуемом материале возбуди­теля или признаков его присутствия, как правило, без выделения чистой культуры. Для этого используют прямой и непрямой варианты ИФ, ИФА, РП, другие иммунные и неиммунные методы индикации. Они не заменяют исследование по классической схеме, а лишь позволяют дать быстрый ориентировочный ответ а ходе диагностики.

2. Выявление иммунного ответа организма на внедрение возбудителя. В зависимости от свойств возбудителя, формы и стадии заболевания, характера иммунного ответа используют 2 метода диагностики:

а) серологический (серодиагностика) - обнаружение в сыворотке крови (serum) специфических иммуноглобулинов (антител), вступаю­щих в реакции иммунитета с диагностикумами из известных микроб­ных антигенов (диагностическое значение имеет высокий титр или выравненное нарастание титра антител в сыворотках, взятых с ин­тервалом 1-3 недели);

б) аллергодиагностика - выявление (in vivo иди in vitro) специ­фической сенсибилизации организма к микробным аллергенам, чаще ГЗТ, обусловленной накоплением сенсибилизированных Т-лимфоцитов (диагностическое значение имеют положительные аллергопробы у больных, которые не привиты или не перенесли данную инфекцию в прошлом).

Диагностика путём выявления иммунного ответа при многих ин­фекциях (особенно острых) носит вспомогательный характер. Её значение снижено рядом причин: иммунный ответ поздно (чаще не ранее 2-й недели заболевания) и лишь косвенно свидетельствует о

контакте с возбудителем; выраженность ответа определяется как свойствами возбудителя, так и состоянием иммунной системы индивидума (иногда ответные реакции не выражены, отсутствуют или от­мечается иммунный ответ к другому возбудителю за счёт перекрёстнореагируюших, групповых, антигенов).

Микробиологическая диагностика вирусных инфекций проводится по тем же принципам, но имеются некоторые особенности:

- при микроскопическом исследовании из-за малых размеров вирусов чаще изучают не морфологию возбудителя, а измененные в ходе вирусной инфекции клетки макроорганизма (отмечают наличие  внутриклеточных включений, ДПД, свечение ядра или цитоплазмы при иммуно-флюоресцентном исследовании);

- для обнаружения вируса обычно материалом от больного заражают живую систему (культуру ткани, куриный эмбрион, животных) и наблюдают за специфическими изменениями, свидетельствующими о репродукции вируса; идентификацию вируса проводят а реакциях иммунитета с известными противовирусными сыворотками (напри­мер, в реакции нейтрализации, РТГА и др.);

- выявление иммунного ответа сводится к определению противови­русных антител в реакциях с живыми известными вирусами иди приготовленными из них инактивированными диагностикумами; вви­ду невысокой антигенности вирусов антитела к ним накапливаются медленно,  в небольших титрах.

Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных потенци­ально- патогенными микробами имеет ряд особенностей;

- поскольку потенциально-патогенные микробы обнаруживаются у здоровых людей в составе нормальной микрофлоры, факт их обнаружения в исследуемом материале не может свидетельствовать об их этиологической роли (причинности) при данном заболевании;

- имеет значение обнаруженные в ходе диагностики количество и локализация возбудителя в организме больного, а также динамика этих показателей в ходе лечения инфекции;

- поскольку часто причиной возникновения такой инфекции является снижение антиинфекционной резистентности, данные о микрофлоре должны сопоставляться с данными о состоянии естественной резис­тентности и иммунного статуса больного в целом;

- для более точного суждения об этиологической роли того иди иного возбудителя проводят изучение его факторов патогенности (определяют вирулентность).

Вирусы образуют самостоятельное царство (Vira) и имеют сле­дующие особенности:

1. Геном представлен одной нуклеиновой кислотой - ДНК или РНК (соответственно выделены 2 подцарства - рибовирусы и дезоксирибовирусы).

2. Неклеточное строение. Нуклеиновая кислота покрыта белковой оболочкой - капсидом, который состоит из отдельных субъединиц - капсомеров (обычно состоит из 5-6 полипептидов).  Капсид вместе с нуклеиновой кислотой образует нуклеокапсид. Такое строение имеют простые вирусы (вирусы полиомиелита, аденовирусы и др.). У сложных вирусов имеется наружная оболочка - суперкапсид, который содержит липиды, гликолипиды. Суперкапсид частично формируется за счет клетки-хозяина.

3. Отсутствие белоксинтезирующих систем (при наличии ферментов адсорбции, распространения, ДНК - и РНК - зависимых полимераз).

4. Абсолютный внутриклеточный паразитизм на генетическом уровне (в том числе возможность интеграции ДНК вируса в клеточный ге­ном и синхронная репликация с ним).

5. Особый (дизъюнктивный) способ размножения: белки вируса синте­зируются на рибосомах пораженной клетки, в других участках -

- нуклеиновая кислота вируса, затем происходит сборка вирусных частиц.

6. Малые размеры; мелкие вирусы (полиовирус и др.) - 25-30 нм (нанометров); средние (вирус гриппа и др.) - 50-125 нм; круп­ные (вирус натуральной оспы) - 150-200 нм.

7.Фильтруемость (проходят через бактериальные фильтры).                  

   8.Кристаллизабельностъ (очищенные от балластных веществ внекле­точные вирусы, вирионы, способны образовывать кристаллы).

9. Форма вирионов (различают палочковидные - у вируса бешенства и др., в виде многогранника, икосаэдр - у аденовирусов, кубоидальной формы - у вируса натуральной оспы, шаровидной - у ви­русов гриппа, головчатые (сперматозоидоподобные) - бактериофа­ги).

Культивирование вирусов    также   имеет   особенности.  Их культивируют на активно размножающихся клетках с повышенной ак­тивностью метаболизма. Использую следующие живые системы. В ор­ганизме лабораторных животных: обычно заражают мышей (взрослых и сосунков), кроликов,   обезьян   (внутримышечно, интраназально, внутрибрюшинно, интрацеребрально, на роговицу). На 9-12-дневных куриных эмбрионах: чаше культивируют на эмбрион-аллантоисной обо­лочке, реже - в аллантоисной или амниотической подсети. На куль­туре клеток:  чаще используют однослойные культуры ткани из ак­тивно размножающихся клеток. Клетки выращивают на естественных питательных средах (эмбриональных экстрактах, лошадиной, челове­ческой сыворотке), ферментативных гидролизатах 5елков (триптический гидролизат лактальбумина), на синтетических средах (на­пример, на среде 199, состоящей из 63 компонентов, в том числе аминокислот, витаминов, глюкозы, солей, человеческой сыворотки, индикатора фенолового красного). Используют следующие типы куль­тур клеток: первично- трипсинизированные (обычно фибробласты куриного эмбриона; они не перевиваются и их надо всегда готовить ex tempore;недостатком является такаю их нестандартность); пе­ревиваемые (одинаковы во всех лабораториях, так как являются оп­ределенным клоном клеток, например, клетки из портальных тканей - амниона человека,  почек эмбриона свиньи; клетки из опухолевых тканей - HeLa (клетки рака шейки матки), НЕр-2 и др. ; недостатком этой группы является то, что клетки часто спонтанно перерождают­ся, становятся   атипичными,   полиплоидными,   а также бывают спонтанно заражены латентными вирусами и микоплазмами); полуперевиваемые диплоидные (например, диплоидные клетки легких человека; они стабильны, спонтанно не перерождаются, не загрязнены вирусами и микоплазмами).

Различают следующие формы вирусных инфекций.  Абортивная ин­фекция (происходит в невосприимчивом иммунном организме): вирус либо не проникает в клетку, либо после проникновения погибает и выталкивается из клетки. Продуктивная инфекция: вирус адсорбиру­ется на чувствительных клетках и проникает в клетку путем погру­жения её мембраны с вирусом внутрь, в цитоплазму клетки (виропексис) ; в образовавшейся фагосоме нуклеиновая кислота вируса освобождается от белковых оболочек ("раздевание вируса"); после окончательного раздевания проникшая в клетку нуклеиновая кислота вируса переключает функционирование клеточного генома и соот­ветствующих метаболических систем клетки на репродукцию вируса;

образованные вирусные частицы выходят из клетки и внедряются в соседние клетки.  Часто такое взаимодействие заканчивается гибелью клетки, этот процесс обозначают как цитопатическое действие (ЦПД). Ранним признаком ЦПД является прекращение митозов; клетка временно набухает, затем деформируется, сморщивается, становится более интенсивно окрашиваемой, отслаивается от стекла (в культу­рах) и погибает. Иногда перед гибелью клетки образуют симпласты (слившиеся многоядерные клетки).  Вирогения: проникшая в клетку нуклеиновая кислота вируса встраивается (интегрирует) в ДНК клетки-хозяина (как в случае умеренного фага) и в форме провируса существует в клетке и передается её потомству. Явление вирогении характерно как для ДНКовых, так и для РНКовых вирусов, так как последние обладают ферментом обратной транскрштазой (напри­мер, ретровирусы).

В основу современной классификации вирусов положен ряд приз­наков, в том числе: тип нуклеиновой кислоты, число капсомеров, наличие суперкапсида, чувствительность к эфиру, круг восприимчи­вых хозяев, патогенностъ, географическое распространение и др.

Вирусы человека (животных и человека)

Особенности противовирусного иммунитета.   Невосприимчивость к вирусным инфекциям может быть обусловлена следующими фактора­ми. Факторы естественной резистентности: клеточная ареактивность (как результат филогенеза человек невосприимчив ко многим вирусным болезням животных и растений); ингибиторы - вещества мукопротеидной или липопротеидной природы, структурно идентичные рецепторам чувствительных клеток (они свободно циркулируют в крови, других жидкостях и блокируют взаимодействие вируса с клеткой); комплемент участвует в формировании специфического (им­мунного) противовирусного ответа (лизоцим и другие гуморальные факторы защитной роли не играют); фагоцитоз носит незавершенный характер, однако лейкоциты, в которые проник вирус, продуцируют интерферон; интерферон синтезируется клеткой после проникновения вируса, он неспецифически ингибирует репродукцию любых вирусов, нарушая синтез вирусных белков на рибосомах (в организме челове­ка активен лишь человеческий интерферон, который продуцируют че­ловеческие лейкоциты, иди гённо-инженерный интерферон - реаферон, продуцируемый кишечной палочкой, в геном которой введен ген человеческого интерферона; интерферон широко применяют для лечения и экстренной профилактики вирусных инфекций); лихорадка (повы­шенная температура нарушает репродукцию вирусов); возрастной фактор (имеет значение, например, при ротавирусной инфекции, ко­торой чаще болеют дети); эндокринные факторы (гипофункция многих желез внутренней секреции отягощает течение вирусных инфекций);

факторы выделительной системы (способствуют освобождению орга­низма от вирусов); формирование внутриклеточных включений , возможно, оказывает защитное влияние (тельца Гварниери при нату­ральной оспе, тельца Бабеша-Негри при бешенстве).

Особенности приобретенного   противовирусного иммунитета в одних случаях обусловливают стойкую невосприимчивость (например, после кори), в других - кратковременную (после риновирусной ин­фекции).Антитела действуют только на внеклеточно расположенные вирусы (поэтому лечение противовирусными иммуноглобулинами про­водят в ранние сроки, пока основная часть вирусов не проникла в

клетки). Клетки, в которые проникли вирусы, синтезируют вирусзависимые антигены и становятся чужеродными для организма, что ве­дет к их уничтожению Т-киллерами. В защитных реакциях имеет зна­чение также местная резистентность :<деток (например, у человека, невосприимчивого к полиомиелиту, клетки нервной ткани и желудочно-кишечного тракта, к которым полиовирус обладает тропизмом, становятся резистентными к вирусу). Секреторные иммуноглобулины (sIgA) - основное звено местного иммунитета на слизистых оболоч­ках. Вакцинация (вирусными вакцинами) создаёт не только специфи­ческий иммунитет в отношении отдельного вируса, но и формирует резистентность к другим вирусам (стимулируется не только выра­ботка антител и образование Т-киллеров, но и выработка интерферона).