Диссертация (Профиль экспрессии микроРНК и генов-мишеней при нарушениях мозгового кровообращения в эксперименте и клинике)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙУНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ И.М. СЕЧЕНОВА МИНИСТЕРСТВАЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ(СЕЧЕНОВСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ)На правах рукописиЖАНИН ИЛЬЯ СЕРГЕЕВИЧПрофиль экспрессии микроРНК и генов-мишеней при нарушенияхмозгового кровообращения в эксперименте и клиникеСпециальности: 03.02.07 – Генетика14.03.03 – Патологическая физиологияДиссертация на соискание ученой степеникандидата медицинских наукНаучные руководители:доктор медицинских наук, профессорАсанов Алий Юрьевичдоктор медицинских наук, профессорПинелис Всеволод ГригорьевичМосква – 20192ОГЛАВЛЕНИЕВведение ..........................................................................................................................

4Внедрение результатов исследования в практику .................................................. 10Глава 1. Обзор литературы ....................................................................................... 121.1 Ишемический инсульт ......................................................................................... 121.1.1 Этиология, классификация, патогенез ......................................................... 121.1.2 Генетические факторы исследования ишемии ..............................................

191.2 микроРНК ............................................................................................................. 231.2.1 История открытия и общие сведения .......................................................... 231.2.2 Биогенез мкРНК ................................................................................................ 251.2.3 Созревание и деградация микроРНК .............................................................. 271.2.4 Строение комплекса RISC................................................................................ 331.3 Роль мкРНК в патогенезе, диагностике и лечении ишемического инсульта 361.3.1 Роль мкРНК в патогенезе инсульта .............................................................

361.3.2 Диагностика, лечение и прогнозирование исхода инсульта ........................ 38Заключение ................................................................................................................. 42Глава 2. Материалы и методы ................................................................................. 432.1 Материалы исследования ....................................................................................

432.2 Методы исследования.......................................................................................... 452.2.1 Метод фотохимически индуцированного тромбоза .................................. 452.2.2 Выделение тотальной РНК и мкРНК из полученных образцов ткани, кровии плазмы ......................................................................................................................

462.2.3 Критерии выбора мкРНК и генов для исследования, составления таблиц ибаз данных ................................................................................................................... 4732.2.4 Метод обратной транскрипции мкРНК и мРНК ............................................

482.2.5 Количественная ПЦР в реальном времени для определения уровняэкспрессии мкРНК и мРНК ....................................................................................... 482.2.6 Статистическая обработка данных.................................................................. 50Глава 3. Результаты .................................................................................................... 523.1 Дифференциальная экспрессия мкРНК в ткани головного мозга крыс,подвергшихся фотохимически индуцированного тромбозу .................................

523.2 Дифференциальная экспрессия мкРНК в лейкоцитах периферической кровикрыс, подвергшихся фотохимически индуцированного тромбозу ....................... 583.3 Дифференциальная экспрессия мРНК в ткани головного мозга крыс,подвергшихся фотохимически индуцированного тромбозу ................................. 633.4 Анализ клинических данных .............................................................................. 68Глава 4. Обсуждение ................................................................................................... 764.1 Обсуждение общих результатов исследования ................................................

764.2 Обсуждение результатов эксперимента с лабораторными животными ........ 784.3 Обсуждение результатов клинической части исследования ........................... 86Заключение ................................................................................................................... 91Выводы ..........................................................................................................................

93Практические рекомендации.................................................................................... 95Перспективы дальнейшей разработки темы ........................................................ 96Список использованных сокращений .................................................................... 97Список литературы .................................................................................................... 994ВведениеАктуальность темы исследованияОдной из ведущих причин смерти в мире является инсульт – остроенарушение мозгового кровообращения.

По данным Всемирной ОрганизацииЗдравоохранения за 2016 год от этого заболевания умерло 5,7 млн. человек, чтосоставляет 10% от показателя общей смертности. Инсульт, цереброваскулярные инейродегенеративные заболевания являются основными причинами потеритрудоспособности и инвалидности у больных с различными социально значимымиболезнями [149].Наиболее часто встречаемым видом инсульта является ишемический инсультили ишемия головного мозга; она составляет 70-85% от общего числа инсультов.Ишемический инсульт – это острое нарушение мозгового кровообращения сповреждением ткани мозга, нарушением его функций вследствие затруднения илипрекращения поступления крови (глюкозная и кислородная депривация) к томуили иному отделу мозга [6].Ишемический инсульт запускает каскад патологических процессов, которыйпочти мгновенно приводит к необратимой гибели нейронов и других клеток впораженном участке мозга. Этот каскад включает в себя глутаматнуюэксайтотоксичность, воспаление, отек и программируемую клеточную гибельнекрозом или апоптозом [123].

Вокруг пораженного участка (ядра инфаркта)развивается область отсроченной клеточной гибели нейронов – так называемая«ишемическая полутень» или «зона пенумбра». От процессов, происходящих в ней,сильно зависит общий объем поражения головного мозга. В синапсах нейронов,попавших в зону пенумбра, происходит неконтролируемое высвобождениеглутамата – основного возбуждающего медиатора центральной нервной системы.Гиперстимуляция глутаматных рецепторов приводит к нарушению ионногогомеостаза клетки (увеличивается содержание Na+ и как следствие Ca2+ внейронах), обменных процессов (энергетического и метаболического), а также5сигнальных путей (в том числе происходят изменения в экспрессии генов,кодирующих основные сигнальные белки).

Со временем, количество нарушений вклетке становится критическим, и она вступает в апоптоз или некроз [125].Ранее для изучения генетических механизмов различных патологий (в томчисле и ишемического инсульта) в основном использовали олиго- или кДНКмикрочипы. С их помощью возможно определить количественные измененияуровня экспрессии нескольких сотен и даже тысяч мРНК одновременно. Однако,это позволяет дать только функциональную оценку процессу, а понять механизмыего возникновения не представляется возможным. Со временем значительновозросло число работ, посвященных молекулам, модифицирующим процесстранскрипции и трансляции. Эти молекулы, по мнению ученых, могли игратьважную роль патогенезе многих заболеваний.

Так в 2006 году Эндрю Файер иКрейг Мелло получили Нобелевскую премию в области физиологии и медициныза изучение РНК-интерференции. Это процесс подавления экспрессии генов натранскрипционном и посттранскрипицонном уровнях. Одними из молекул,принимающими участие в РНК-интерференции, являются микроРНК (мкРНК). Этималые некодирующие РНК при связывании с мРНК-мишенью могут вызывать еедеградацию, дестабилизацию, либо подавлять трансляцию.

мкРНК можновстретить как у млекопитающих, так и у растений и даже у вирусов. У животныхэти молекулы существуют во всех клетках, описан целый ряд мкРНК,экспрессирующихся в головном мозге. Более того, обнаружены внеклеточныециркулирующие мкРНК в плазме крови и в спинномозговой жидкости [29, 101].РНК-интерференция – это очень тонкий, но мощный механизм регуляцииэкспрессии генов: одна мкРНК может угнетать трансляцию десятка или сотнимРНК; трансляция одной мРНК может угнетаться десятком или сотней мкРНК.Схема взаимодействия мкРНК и мРНК похожа на очень разветвленную«нейронную сеть».Было показано, что мкРНК играют существенную роль в различныхнейробиологических процессах, таких как нейрогенез, рост нейритов, а такжесинаптогенез [143]. К настоящему моменту известно только несколько мкРНК,6специфичных для ишемического инсульта.

Они влияют на патогенетическиефакторы и в перспективе могут использоваться в прогнозировании исхода или дажетерапии заболевания [159].Так, в ряде работ было найдена корреляция между уровнем экспрессиимкРНК (miR-296–5p, let-7e-3p) и риском артериальной гипертензии – одной изпричин инсульта [80]. В других работах было показано, что повышение экспрессииmiR-15a-3p и miR-497-5p подавляет активность антиапоптотического белка Bcl2,при использовании специфических ингибиторов мкРНК (PPARδ для miR-15a-3pили антагомиров для miR-497-5p), в результате, происходило сокращение зоныинфаркта и снижение неврологического дефицита [123].В ряде исследований, посвященных изучению динамики изменения профиляэкспрессии мкРНК, была показана зависимость профиля их экспрессии от временивзятия образца в период острого ишемического инсульта или восстановления.Также было установлено, что экспрессия мкРНК зависит от стадии инсульта иизменяется со временем [50].Однако, несмотря на интенсивные исследования, отсутствуют данные обобщем реестре мкРНК, участвующих в развитии ишемии головного мозга.

Этосвязано со многими факторами: различными допущениями при моделированиипатологии,разнымиспособамиоценкиуровняэкспрессиимкРНКидоказательством их активности. На данный момент существуют исследования,выполненные у экспериментальных животных с различными формами инсультаили черепно-мозговой трвмой. Однако, имеются лишь единичные работы,посвещенных изучению экспрессии мкРНК при ишемическом инсульте набольных; те исследования, которые есть, в основном направлены на изучениеузкого спектра (иногда до единичных) мкРНК [159].Таким образом, актуальность и перспективность исследования профиляэкспрессии мкРНК в эксперименте и в клинике не вызывает сомнений. Разработкаданной проблемы представляет интерес как для фундаментальной генетики, так идля практической медицины.7Цель исследования:ПровестисравнительныйанализпрофилейэкспрессиимкРНКисоответствующих генов-мишеней в ткани мозга и крови крыс с фокальнойишемией мозга и больных с инсультом (острый период) при нарушении мозговогокровообращения для оценки возможности их использования в качествебиомаркеров ишемического повреждения.Задачи исследования:1.