Диссертация (Разработка и экспериментальное обоснование применения метода направленной тканевой регенерации костной ткани с использованием аутологичных клеток)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ«МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙМЕДИКО-СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТИМЕНИ А. И. ЕВДОКИМОВА»МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИНа правах рукописиХашукоев Адальби ЗаурбиевичРАЗРАБОТКА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА НАПРАВЛЕННОЙ ТКАНЕВОЙРЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМАУТОЛОГИЧНЫХ КЛЕТОК14.01.14 – стоматология (медицинские науки)14.03.03 – патологическая физиология (медицинские науки)ДИССЕРТАЦИЯна соискание ученой степеникандидата медицинских наукНаучные руководители:доктор медицинских наук, профессорМаркин Владимир Александровичкандидат медицинских наукЛюндуп Алексей ВалерьевичМосква–20182ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................................................

4ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 5ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................. 121.1. Анатомо-топографические характеристики протезного ложа, особенностипротезирования и способы фиксации зубных протезов ............................................121.2. Метод направленной регенерации костной ткани ..............................................

161.3. Применение стволовых клеток и их сочетание с остеопластическимиматериалами ................................................................................................................... 211. 4. Методы, направленные на репаративные процессы в костной тканичелюстей ......................................................................................................................... 25ГЛАВА 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .................................... 312.1. Работа с культурами мезенхимальных стволовых клеток из десны ..................312.1.1. Забор биоматериала-источника клеток ................................................... 312.1.2. Выделение мезенхимальных стволовых клеток из десны кролика…..322.1.3. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток из десныкролика .................................................................................................................322.1.4.

Замораживание, криохранение и размораживание мезенхимальныхстволовых клеток из десны кролика ................................................................. 332.1.5. Дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток из десныкролика .................................................................................................................332.1.6.

Иммунофенотипический анализ культур мезенхимальных стволовыхклеток из десны кролика .................................................................................... 332.1.7. Хондрогенная дифференцировка культур мезенхимальных стволовыхклеток из десны кролика .................................................................................... 362.1.8. Адипогенная дифференцировка культур мезенхимальных стволовыхклеток из десны кролика .................................................................................... 372.1.9.

Остеогенная дифференцировка культур мезенхимальных стволовыхклеток из десны кролика .................................................................................... 3832.2. Материалы и методы создания прототипа биомедицинского клеточного продукта на основе остеозамещающего материала и аутологичных клеток ................ 382.2.1.

Остеопластические материалы для скрининга на линейныхклеточных культурах .......................................................................................... 392.2.2. Метод подготовки остеозамещающего материала для определенияцитосовместимости (скрининга) ....................................................................... 402.3. Материалы и методы экспериментальных исследований на животных ..........

432.4. Материалы и методы рентгенологического исследования ................................502.5. Материалы и методы клинического исследования ............................................ 52ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ............................633.1. Результаты скрининга остеопластических материалов ..................................... 633.2. Результаты морфологического изучение костной ткани нижней челюстикролика после имплантации разработанной композиции композиционногоматериала для замещения костных дефектов ............................................................. 663.3.

Результаты рентгенологических исследований .................................................. 823.4. Результаты клинического исследования ............................................................. 86ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ .............................. 100ВЫВОДЫ ..................................................................................................................... 110ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.....................................................................

111СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................... 1124СПИСОК СОКРАЩЕНИЙАО–альвеолярный отростокГА–гидроксиапатитДО–дистракционный остеогенезЛДФ –лазерная допплеровская флоуметрияМБК –морфогенетический белок костиМСК –мезенхимальные стволовые клеткиНКР –направленная костная регенерацияСК–стволовые клеткиСО–слизистая оболочкаHU–единица ХаунсфилдаPLLA –поли-L-молочная кислотаPRF–фибрин, обогащенный тромбоцитамиPRP–плазма, обогащенная тромбоцитами5ВВЕДЕНИЕАктуальность темы исследования и степень её разработкиВ настоящее время для реабилитации пациентов со сложным рельефомпротезного ложа существует множество методов, основным из которыхявляется направленная костная регенерация (НКР) с применением различныхостеозаменяющих материалов, биологических мембран и стволовых клеток(СК).Одним из наиболее быстро развивающихся и успешно применяемыхметодовявляетсятканеваяинженерия,позволяющаяэффективновосстанавливать костные дефекты.Очевидно, что будущее именно за тканевой инженерией, при этомпроверенные временем хирургические методы, стимулирующие репаративныепроцессы в костной ткани, не утратили своей значимости и также широкоприменяются при различных видах протезирования.Выборнаилучшегометодареабилитациивозможентолькоиндивидуально после тщательного обследования пациента и обсуждения с нимдостоинств и недостатков разных методов.Выявлено, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК) обладаютиммуномодулирующим эффектом, ингибируют пролиферацию Т-клеток иснижают вероятность возникновения и степень выраженности реакции«трансплантатпротивхозяина»присовместнойтрансплантациисгемопоэтическими СК.

При этом они существенно ускоряют восстановлениеповрежденного гемопоэза. Полученные данные о том, что МСК не содержатмембранных маркеров, характерных для гемопоэтических клеток, а такжеантигенов гистосовместимости, позволяют рас сматривать МСК в качествекандидатов не только для аутологичной, но и для аллогенной клеточнойтерапии [9].Результатом трансплантации больным МСК костного мозга может бытьвосстановление популяции СК в различных органах. Стромальные клеткиявляются источником важных цитокинов и ростовых факторов, которыеспособствуют активированию и нормализации иммунного ответа, сниженного в6результатеболезни,атакжеразвитиюрегенеративныхпроцессоврекомендацийвыделенияповрежденных тканях и органах.Разработкаметодовималоинвазивными методамипрактическихаутологичных МСК-десны для повышениеэффективности направленной регенерации костной ткани челюстей путем исочетаннное приминение их с биосовместимым остеопластическим материаломявляютсяактуальнымизадачамистоматологии.Отсутствиедетальныхисселедований в этой области стоматологии, определило цели и задачи даннойнаучной работы.Цельисследования:повышениеэффективностинаправленнойрегенерации костной ткани челюстей путем использования культивированныхаутологичныхМСК-десны,вкомбинациисбиосовместимымостеопластическим материалом.Задачи исследования:1.Разработать технологию получения культуры мезенхимальных стволовыхклеток, выделенных из прикрепленной ткани десны кроликов, в соответствиис требованиями, предъявляемыми к биомедицинским клеточным продуктам.2.Провести сравнительный анализ остеопластических материалов в качествематрицы-носителя для мезенхимальных стволовых клеток путем исследованияцитосовместимости со стандартными линиями клеток.3.Создать технологию получения биомедицинского клеточного продуктасостоящего из цитосовместимого остеопластического материала и МСК изклеток десны для последующей имплантацией в область тела дефекта нижнейчелюсти.4.Провести сравнительный анализ эффективности замещения дефекта костнойткани челюстей при имплантации цитосовместимого остеопластическогоматериалаибиомедицинскогоклеточногопродукта,состоящегоизостеопластического биоматериала и МСК из прикрепленной десны с и безаутологичных мезенхимальных стволовых клеток десны с использованиемсовременных рентгенологических и других методов исследования.5.Оценить на морфофункциональном уровне степень и характер влияниябиомедицинского клеточного продукта, состоящего изцитосовместимого7остеопластического материала и аутологичных МСК из прикрепленной десны,на динамику регенерации костной такни при замещении дефекта нижнейчелюсти.6.Апробироватьразработаннуюбиокомпозициюсаутологичнымимезенхимальными стволовыми клетками десны в клинике при лечениипациентов с интраоперационными дефектами челюстных костей.Научная новизнаВпервыепроведеностеопластическихскринингматериаловнакоммерческидоступныхцитосовместимостьсвРоссиииспользованиемстандартной клеточной линии 3Т3/NIH.Впервые был разработан прототип биомедицинского клеточного продукта наосновевыбранногонаиболеецитосовместимогокоммерческогоостеопластического материала Bio Oss и аутологичных МСК десны длявосстановления обширных костных дефектов челюстей.Впервые выявлено, что при использовании биокомпозиции с аутологичнымиМСК десны при восполнениистандартных операционных дефектов челюстейстабилизация микроциркуляторных параметров наступает через 4 месяца а не через6 как при использовании биокомпозиции без МСК, что характеризует болеевыраженный репаративный остеогенез в зоне дефекта.Разработан протокол получения МСК десны в контролируемых условияхчистыхпомещений6-5классовпоИСО,проведеныисследования,подтверждающие их фенотип стволовых клеток, в соответствии с рекомендациямиМеждународного общества клеточной терапии.Разработан способ замещения костных дефектов челюстей (№ 2 692 452.).Разработанкомпозиционный материал для замещения костных дефектовчелюстей (№ 2 685 148.).Теоретическая и практическая значимость работыОсновные положения, выносимые на защиту:Определеностеокондуктивныйпрепарат,наиболееподходящийдлясочетанного применения с аутологичными клетками пациента для восстановлениякостных дефектов челюстей.ОпределенаметодикакультивированияМСКиздесныпациента,8участвующих в изготовлении композиционного материала для восстановлениякостных дефектов челюстей.Разработанный композиционный материал и способ замещения костныхдефектов челюстей позволяют повысить эффективность лечения пациентов скостными дефектами челюстей.1.Разработанная нами методика изготовления прототипа биомедицинскогоклеточного продукта, позволяет сохранять высокую жизнеспособностьклеточного компонента, состоящего из мезенхимальных стволовых клетокдесны до его имплантации в зону костного дефекта.2.Разработанный нами прототип биомедицинского клеточного продукта наосновевыбранногоостеопластическогоматериалаимезенхимальныхстволовых клеток десны в дозе 1×106 клеток/см3 полностью и в более ранниесроки восстанавливает объемные дефекты челюстей в модели их стандартногоповреждения.3.Результаты комплексного исследования, включающего мультиспиральнуюкомпьютерную томографию с денситометрией и морфологические методы,позволяют в полной мере оценить полноту и скорость замещения объемногодефекта кости в эксперименте in vivo.4.Клинико-рентгенологическиеивосстановлениякостнойтканииспользованиябиокомпозициидопплерографическиехарактеристикидоказываютэффективностьсвысокуюаутологичнымимезенхимальнымистволовыми клетками десны при замещении костных интраоперационныхдефектов.Личное участие автораАвтор самостоятельно провеланализ литературы современного состоянияпроблемы получения аутологичных клеток и возможных вариантов замещениякостных дефектов челюстей с использованием традиционных методик и спомощью клеточных технологий.Автор самостоятельно оперировал лабораторных животных в рамкахпроводимогоэксперимента,подготавливалживотныхдляпроведениямикрофокусной компьютерной томографии, выполнял первый технологический9этап получения прототипа биомедицинского клеточного продукта – забораутологичного биоматериала животных для последующего выделения популяциицелевыхклеток.Подготавливалиописывалгистологическиепрепараты,отражающих результаты экспериментальных исследований.Автор самостоятельнопровел статистическую обработку полученныхматериалов, подготовил публикации, диссертацию и автореферат.Степень достоверности и апробация результатовОсновные положения диссертации доложены и обсуждены на следующихконференциях: 14-м Всероссийском стоматологическом форуме выставке-ярмаркеДЕНТАЛ-РЕВЮ 2017 «Стоматологическое образование.